鏈霉菌Streptomyces sp.KIB-H1424中的一個新的烷基間苯二酚類化合物

張周鑫，侯冠雄，馬亞團，黃建萍，羅劍英，楊 靜，顏一軍，黃勝雄*

1云南大學化學科學與工程學院，昆明 650091；2中國科學院昆明植物研究所植物化學與西部植物資源持續利用國家重點實驗室，昆明650201；3云南中醫學院中藥學院，昆明650500

放線菌(Actinomycetes)是廣泛存在于各種自然生境中的一類微生物，種類繁多，代謝特征各異[1]。在迄今為止發現的近萬種天然抗生素中，約70%是放線菌合成的。鏈霉菌是放線菌門中種類最多的一個屬，廣泛分布于土壤、海洋、極端環境以及一些生物體內[2]。鏈霉菌合成的抗生素數量更是占到了天然抗生素總量的52%[3-6]。烷基間苯二酚是一類從植物、海洋生物以及微生物中分離到的具有良好生物活性的天然產物[7-10]，具有DNA解旋[8]、糖蛋白抑制[7]和甘油-3-磷酸脫氫酶抑制等活性[9]。此外，有些烷基間苯二酚還具有一定的抗真菌[11]、細菌[12]及細胞毒性[13]。在從微生物中尋找新的活性次生代謝產物的過程中[14,15]，我們對一株鏈霉菌Streptomycessp.KIB-H1424發酵液的化學成分進行了研究，得到6個烷基間苯二酚類化合物(化合物1～6)。本文詳細介紹了6個化合物的分離純化、結構鑒定和生物活性。

圖1 化合物1～6的化學結構Fig.1 Chemical structures of compounds 1-6

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

Bruker DRX-500、Avance III-400 核磁共振儀(TMS作為內標，δ為ppm)，Waters Xevo TQ-S超高壓液相三重四級桿聯用質譜儀；ZQZY-HC恒溫搖床(上海知楚儀器)，日本三菱化學MCI GEL CHP 20P填料(70～150 μm)，Sephadex LH-20(瑞典AIRTECH生物化學試劑公司生產)，Hitachi Chromaster 5430 高效液相色譜儀器(日立)，YMC-Triart C18型液相色譜柱(250×10 mm I.D.)，中速濾紙(杭州新華紙業有限公司)，YXQ-LS-18SI 高壓蒸汽滅菌鍋(上海博迅實業有限公司醫療設備廠)。其他試劑為國產分析純試劑(天津市大茂化學試劑廠，廣東環凱微生物科技有限公司)。

1.2 發酵菌株

發酵菌株KIB-H1424分離自云南省玉溪市元江縣采集的蝦子花(Woodfordiafruticosa(L.)Kurz.)根部土壤樣本。菌株經過16S rRNA基因測序分析，將測序結果與GenBank數據庫中相關菌株進行同源性比對，發現其與Streptomycestumescensstrain OTP-4-2的基因序列的相似度達到99.0%。同時結合其形態學與培養特征，確定其為鏈霉菌屬，命名為Streptomycessp.KIB-H1424。活性測試菌株金黃色葡萄球菌(StaphylococcusaureusATCC 6538)、枯草芽孢桿菌(BacillussubtilisATCC 6633)、斜臥青霉(PenicilliumdecumbensATCC 10436)購買自ATCC菌種庫，小麥赤霉病菌(Fusariumgraminearum)、白色念珠菌(Moniliaalbican)、棉花枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.Vasinfectum)由西北農林科技大學馬亞團提供。目前發酵與活性測試菌株均保存在中國科學院昆明植物研究所植物化學與西部植物資源可持續利用國家重點實驗室。

1.3 培養基與培養條件

固體培養基：MS培養基，配方為大豆粉20.0 g/L(煮沸后過濾取濾液)，甘露醇20.0 g/L，瓊脂粉20.0 g/L，pH=7.0。

種子液培養基：TSB培養基，配方為胰蛋白胨17.0 g/L，大豆蛋白胨3.0 g/L，氯化鈉5.0 g/L，磷酸氫二鉀2.5 g/L，右旋葡萄糖2.5 g/L，pH=7.3 ± 0.2。

PDA培養基：200.0 g去皮土豆切碎后加入1.0 L自來水，煮沸30 min，四層紗布過濾后，濾液加入瓊脂粉20.0 g，右旋葡萄糖20.0 g，定容1.0 L，自然pH。

LB培養基：胰蛋白胨10.0 g/L，酵母提取物5.0 g/L，氯化鈉 10.0 g/L，瓊脂粉20.0 g/L，pH=7.4。

發酵培養基：M15培養基，配方為右旋葡萄糖30.0 g/L，胰蛋白胨1.0 g/L，牛肉膏5.0 g/L，氯化鈉l5.0 g/L，碳酸鈣2.5 g/L，微量鹽1.0 mL(微量鹽配方：七水合硫酸亞鐵1.0 g，五水硫酸銅0.45 g，七水合硫酸鋅1.0 g，四水硫酸錳0.1 g，鉬酸鉀0.1 g溶于1.0 L蒸餾水中，加鹽酸使溶液澄清)，pH=7.2。

將MS平板上活化好的菌株接種至裝有50 mL種子液的250 mL三角搖瓶中，置于搖床中，28 ℃、200 rpm培養2天。將種子液按5%接種量轉接到裝有250 mL發酵培養基的1 L三角搖瓶中，置于搖床中，在28 ℃、200 rpm條件下培養7天。

1.4 提取分離

發酵液以4 000 rpm 的轉速離心20 min。上清液與菌絲體分別用等體積乙酸乙酯萃取3遍。經HPLC分析后，合并上清與菌絲體乙酸乙酯萃取物共4.0 g。粗提物經MCI依次用甲醇-水(10∶90- 100∶0)梯度洗脫，得到Fr1～Fr9共九個組分。Fr7組分經Sephadex LH-20(甲醇洗脫)，TLC分析后合并，得到Fr7A～Fr7D四個組分。Fr7D組分經HPLC分離，以80%乙腈等度洗脫得到六個化合物分別是2(tR=16.8 min,11.7 mg),3(tR=18.2 min,15.0 mg),4(tR=19.2 min,12.9 mg),1(tR=21.1 min,8.7 mg),5(tR=22.0 min,9.4 mg),6(tR=23.0 min,12.3 mg)。

1.5 活性測試(濾紙片法)

將保存在20%甘油中的指示菌株金黃色葡萄球菌(StaphylococcusaureusATCC 6538)、枯草芽孢桿菌(BacillussubtilisATCC 6633)、小麥赤霉病菌(Fusariumgraminearum)、斜臥青霉(PenicilliumdecumbensATCC 10436)、白色念珠菌(Moniliaalbican)、棉花枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.Vasinfectum)分別接種至PDA與LB培養基上活化培養，分別以28 ℃與37 ℃避光培養4天，待其菌落基本長滿培養基待用。將被測化合物和多菌靈均配置成濃度2.0 mg/mL的丙酮溶液備用。將活化好的指示菌株分別加入到約40 ℃的PDA與LB培養基中(300 mL培養基中加入一個培養皿的菌體)并倒入培養皿中(每個培養皿倒入約25 mL培養基)，待瓊脂凝固后，十字線標記。在無菌濾紙片(直徑5 mm)中心滴加5 μL待測化合物的丙酮溶液，待丙酮揮發后將其放置到培養基上。每塊培養基平板均以丙酮作陰性對照，分別以卡那霉素(2.0 mg/mL)、放線菌酮(2.0 mg/mL)與制霉菌素(2.0 mg/mL)作陽性對照。最后，真菌在28 ℃，細菌在37 ℃培養箱中培養24～48 h后觀察抑菌圈大小，用十字交叉法測量抑菌圈直徑。

2 結果與分析

2.1 化合物結構鑒定

化合物1白色粉末；UV (MeOH)λmax (logε) 203 (2.5),219 (2.0),277 (1.3).IR (KBr)νmax3 355,3 063,2 954,2 920,2 869,2 850,1 598,1 469,1 156 cm-1;。HR-ESI-MS (negative)圖譜給出m/z347.2954[M-H]-(calcd for 347.2956)，結合13C-NMR確定分子式為C23H40O2。13C-NMR中整個譜圖明顯的分成低場和高場兩部分。高場部分δC30.7存在大量重疊的碳信號并且氫譜在δH1.29也存在大量重疊的信號，推測有脂肪鏈的存在。低場部分碳譜信號δC100.9,107.9,146.3,159.3結合氫譜信號δH6.08 (1H,t,J=2.2 Hz),6.12 (2H,d,J=2.2 Hz)(見表1)推測可能存在1,3,5取代的間苯二酚結構單元。結合HMBC譜中δH6.08的氫與δC159.3,107.9存在HMBC的相關，同時δH6.12也存在與δC159.3,107.9,100.9,37.0的HMBC相關信號，進一步確定了間苯二酚結構單元的存在，并且間苯二酚單元在5位上與δC37.0相連(見圖2)。結合δH1.22～1.37 (22H,m),1.55 (2H,m)與2.43 (2H,t,J=7.6 Hz)的1H-1H COSY相關確定脂肪鏈的一端通過δC37.0與間苯二酚相連。與此同時δH1.53 (1H,m),1.17 (2H,m)與0.88 (6H,d,J=6.6 Hz)的1H-1H COSY相關揭示了脂肪鏈的另一端為異丙基單元。綜上，確定化合物1的結構如圖所示(見圖1)。化合物1的核磁及其它相關詳細結構鑒定數據原始圖譜可從本刊官網免費下載(www.trcw.ac.cn)。

圖2 化合物1 的關鍵COSY和HMBC相關信號Fig.2 The Key COSY and HMBC correlations of compound 1

原子編號PositionAdipostatin E (1)δCδH(mult,J in Hz)1,3159.3-2100.96.08 (1H,t,J=2.2 Hz)4,6107.96.12 (2H,d,J=2.2 Hz)5146.3-737.02.43 (2H,t, J = 7.6 Hz)832.41.55 (2H,m)930.61.22～1.371030.7～30.81.22～1.371130.7～30.81.22～1.371230.7～30.81.22～1.371330.7～30.81.22～1.371430.7～30.81.22～1.371530.7～30.81.22～1.371630.7～30.81.22～1.371731.01.22～1.371830.31.22～1.371928.51.22～1.372040.31.17 (2H,m)2129.21.53 (1H,m)22,2323.00.88 (6H,d,J=6.6 Hz)Data were measured in methanol-d4

化合物2白色粉末；分子式C21H36O2;ESI-MS:m/z319[M - H]-;1H NMR (CD3OD,400 MHz)δ:6.12 (2H,d,J=2.2 Hz,H-4,H-6),6.08 (1H,t,J=2.2 Hz,H-2),2.43 (2H,t,J=7.6 Hz,H-7),1.56 (2H,m,H-8),1.37～1.22 (24H,m,H-9～H-20),0.90 (3H,t,J=6.7 Hz,H-21);13C NMR (CD3OD,100 MHz)δ:159.3 (C-1,C-3),146.3 (C-5),107.9 (C-4,C-6),100.9(C-2),37.0 (C-7),33.1 (C-19),32.4 (C-8),30.8～30.3 (C-9～C-18),23.7 (C-20),14.5 (C-21)。以上數據與文獻[16]報道一致，故鑒定為Adipostatin A。

化合物3白色粉末；分子式C21H36O2;ESI-MS:m/z319[M- H]-;1H NMR (CD3OD,400 MHz)δ:6.12 (2H,d,J=2.2 Hz,H-4,H-6),6.08 (1H,t,J=2.2 Hz,H-2),2.43 (2H,t,J=7.6 Hz,H-7),1.56 (2H,m,H-8),1.37～1.22 (18H,m,H-9～H-17),0.90 (6H,t,J=6.6 Hz,H-20,H-21);13C NMR (CD3OD,100 MHz)δ:159.3 (C-1,C-3),146.3 (C-5),107.9 (C-4,C-6),100.9 (C-2),40.2 (C-18),37.0 (C-7),32.4 (C-8),30.8～30.4 (C-9～C-16),29.1 (C-19),28.5 (C-17)，23.0 (C-20,C-21)。以上數據與文獻[16]報道一致，故鑒定為Adipostatin B。

化合物4白色粉末；分子式C22H38O2;ESI-MS:m/z333[M- H]-;1H NMR (CD3OD,400 MHz)δ:6.12 (2H,d,J=2.2 Hz,H-4,H-6),6.08 (1H,t,J=2.2 Hz,H-2),2.43 (2H,t,J=7.6 Hz,H-7),1.56 (2H,m,H-8),1.37～1.22 (26H,m,H-9～H-21),0.90 (3H,t,J=6.7 Hz,H-22);13C NMR (CD3OD,100 MHz)δ:159.3 (C-1,C-3),146.3 (C-5),107.9 (C-4,C-6),100.9 (C-2),37.0 (C-7),33.1 (C-20),32.4 (C-8),30.8～30.4 (C-9～C-19),23.7 (C-21),14.5 (C-22)。以上數據與文獻[16]報道一致，故鑒定為Adipostatin C。

化合物5白色粉末；分子式C22H38O2;ESI-MS:m/z333[M- H]-;1H NMR (CD3OD,400 MHz)δ:6.12 (2H,d,J=2.2 Hz,H-4,H-6),6.08 (1H,t,J=2.2 Hz,H-2),2.43 (2H,t,J=7.6 Hz,H-7),1.55 (2H,m,H-8),1.52 (1H,m,H-20),1.37～1.22 (20H,m,H-9～H-18),1.15 (2H,m,H-19),0.86 (6H,m,H-21,H-22);13C NMR (CD3OD,100 MHz)δ:159.3 (C-1,C-3),146.3 (C-5),107.9 (C-4,C-6),100.9 (C-2),40.3 (C-19),37.0 (C-7),32.4 (C-8),31.0 (C-9),30.8～30.7 (C-10～C-15),30.6 (C-16),30.3 (C-17),29.2 (C-20),28.5 (C-18),23.0 (C-21,C-22)。以上數據與文獻[16]報道一致，故鑒定為Adipostatin D。

化合物6白色粉末；分子式C23H40O2;ESI-MS:m/z347[M- H]-;1H NMR (CD3OD,400 MHz)δ:6.12 (2H,d,J=2.2 Hz,H-4,H-6),6.08 (1H,t,J=2.2 Hz,H-2),2.43 (2H,t,J=7.6 Hz,H-7),1.56 (2H,m,H-8),1.37～1.22 (28H,m,H-9～H-22),0.89 (3H,t,J=6.7 Hz,H-23);13C NMR (CD3OD,100 MHz)δ:159.3 (C-1,C-3),146.3 (C-5),107.9 (C-4,C-6),100.9 (C-2),37.0 (C-7),33.1 (C-21),32.5 (C-8),30.8～30.4 (C-9～C-20),23.7 (C-22),14.5 (C-23)。以上數據與文獻[17]報道一致，故鑒定為5-Heptadecyl-1,3-benzenediol。

2.2 化合物抑菌活性實驗

以6株指示菌金黃色葡萄球菌(StaphylococcusaureusATCC 6538)、枯草芽孢桿菌(BacillussubtilisATCC 6633)、小麥赤霉病菌(Fusariumgraminearum)、斜臥青霉(PenicilliumdecumbensATCC 10436)、白色念珠菌(Moniliaalbican)、棉花枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.Vasinfectum)為指示菌株檢測6個化合物的抗菌活性。結果顯示6個化合物對所選的6株指示菌均無明顯抑制活性。

3 討論

本研究從鏈霉菌Streptomycessp.KIB-H1424 的發酵液中分離得到了6個間苯二酚類化合物——1個新的烷基間苯二酚類化合物1和5個已知的化合物(化合物2～6)。化合物2和3第一次被發現是作為甘油-3-磷酸脫氫酶抑制劑在鏈霉菌S.cyaneus2299-SV1中被分離得到[9]。后來，Mostafa等[16]對化合物2～5的研究又發現了其對成年馬來絲蟲(Brugiamalayi)的殺滅活性。本研究中的6個間苯二酚化合物對所選的6株指示菌雖沒有明顯的抗菌活性，但豐富了間苯二酚類化合物的種類，為鏈霉菌來源化合物的藥物開發利用提供了一定的化學基礎，為醫藥及天然產物開發提供了理論和物質基礎。