干燥方式對尾巨桉樹皮提取物總?cè)坪考捌錃⒙莼钚缘挠绊?/h1>
2019-10-11 05:46:18李晶晶甘金佳
天然產(chǎn)物研究與開發(fā) 2019年9期
李晶晶，甘金佳，莫 玲，程 浩
1桂林醫(yī)學院公共衛(wèi)生學院，桂林 541004； 2中國科學院廣西植物研究所，桂林 541006
福壽螺Pomaceacanaliculata，原產(chǎn)于南美洲，是一種嚴重危害農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及人類健康的世界性惡性外來入侵物種，也是我國環(huán)保部公布的首批入侵我國的16種“危害最大的外來物種”之一。在我國，受到福壽螺入侵災害影響的包括我國長江以南的十幾個省區(qū)，給當?shù)氐乃竞退魑锓N植造成了巨大經(jīng)濟損失和生態(tài)災害[1,2]；同時，福壽螺還是能引起人類嗜酸性腦膜炎的廣州管圓線蟲的中間宿主，危害人類健康[3]。目前化學藥劑滅螺是最主要的控制福壽螺措施，但目前登記的殺螺藥劑極少(僅有殺螺胺類和四聚乙醛兩種)，且存在毒性大、污染環(huán)境、抗藥性以及價格昂貴等缺點[4,5]，使福壽螺防治始終是困擾人們的巨大難題。因此，尋找對環(huán)境安全、高效、低毒的天然源殺螺藥劑勢在必行。
桉樹是桃金娘科(Myrtaceae)桉屬(Eucalyptus)植物，是世界上種植面積最廣的樹種之一。桉樹皮中含有單寧[6]、三萜[7-9]、間苯三酚、黃酮類、單萜、酚酸、甾醇等化學成分[10-12]，是一種可以重復利用的生物資源。在前期研究中，我們發(fā)現(xiàn)桉樹皮提取物對福壽螺具有很強的毒殺活性，其主要的活性成分為五環(huán)三萜類化合物[8,9]，可能是一種有開發(fā)潛力的植物源殺螺藥劑，值得進一步研究其作用機理。桉樹皮作為桉樹木材加工業(yè)的主要副產(chǎn)品，資源非常巨大。桉樹在我國的種植面積已達450 hm2，年產(chǎn)木材超過3 000萬m3[13]，根據(jù)桉樹皮產(chǎn)量為原木產(chǎn)量的11%計算[14]，年產(chǎn)桉樹皮約330萬m3。目前，我國絕大部分桉樹皮通常被直接丟棄，其中的活性物質(zhì)沒有得到充分利用造成了巨大的浪費。
目前對于桉樹皮的研究主要集中在其化學成分及抗氧化、抑菌活性方面，在農(nóng)藥領域的應用僅有我們研究團隊進行了少量研究，總體來說，桉樹皮資源尚未得到充分利用。廣西是我國桉樹種植面積最大的省，尾巨桉(Eucalyptusurophylla×Eucalyptusgrandis)是廣西目前主要種植的桉樹樹種，目前有關尾巨桉樹皮對福壽螺的毒殺活性及作用機理的研究尚未見報道。本研究主要考察不同干燥方式和乙醇提取濃度對桉樹皮乙醇提取物中總?cè)坪亢蜌⒙莼钚缘挠绊懀y定經(jīng)桉樹皮乙醇提取物處理后福壽螺頭足部、肝臟中蛋白質(zhì)含量及酶活性的變化，初步探討其殺螺作用機理，以期為桉樹皮在農(nóng)藥領域的開發(fā)應用提供實驗室基礎。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料
新鮮剝落尾巨桉E.urophylla×E.grandis樹皮采自廣西柳州鹿寨縣黃冕林場，由廣西壯族自治區(qū)中國科學院廣西植物研究所姚月鋒副研究員鑒定。
1.1.2 供試軟體動物
福壽螺Pomaceacanaliculata幼螺采自桂林市農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)場水稻田溝邊，于實驗室飼養(yǎng)7天后，選用大小一致、無損傷的幼螺供室內(nèi)試驗。
1.1.3 主要儀器和試劑
FE-130植物粉碎機(河北黃曄科學儀器廠)，EYELA-1型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(日本Tokyo Rikakikai公司)，101A-1E型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海實驗儀器有限公司)，F(xiàn)E-1CE型多歧管冷凍干燥機(博醫(yī)康科技公司)，LUX型多功能性酶標儀(美國Thermo Fisher Scientific 公司)，Biomate3S型紫外可見光分光光度儀 (美國Thermo Fisher Scientific 公司)。茶皂素原粉：中國農(nóng)科院茶葉研究所提供，含量60%。考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒、LDH(乳酸脫氫酶)試劑盒、 AKP(堿性磷酸酶)試劑盒、ALT/GPT(谷丙轉(zhuǎn)氨酶)試劑盒、AST/GOT(谷草轉(zhuǎn)氨酶)試劑盒：南京建成生物工程中心；其余試劑為國產(chǎn)分析純。
1.2 方法
1.2.1 尾巨桉樹皮乙醇提取物的制備
取新鮮剝落的尾巨桉樹皮，置于通風陰涼處陰干至水分含量為9%，粉碎后過60目篩。分別稱取200.0 g尾巨桉樹皮粉末，按料液比為1 g∶40 mL的比例，分別加入體積分數(shù)為40%、60%、80%、90%的乙醇水溶液，超聲波提取2 h(功率500 w，溫度60 ℃)，經(jīng)布氏漏斗抽濾后收集濾液。上述過程重復2次，合并濾液。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將上述濾液減壓濃縮得到樹皮乙醇提取物浸膏，置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>
1.2.2 尾巨桉樹皮乙醇提取物的干燥處理
稱取在4 ℃冰箱中保存的尾巨桉樹皮乙醇提取物浸膏，分別置于恒溫鼓風干燥箱及冷凍干燥機中干燥至恒重。鼓風干燥條件為40 ℃，干燥24 h。冷凍干燥條件為，先在-20 ℃冰箱中預凍24 h，冷阱溫度-40 ℃，真空度0.025 MPa，干燥時間約48 h。兩種不同干燥方式干燥后的樹皮乙醇提取物研磨成粉末后過篩(100目)，分別放入密封袋內(nèi)保存，用于活性成分和生物活性測定。
1.2.3 尾巨桉樹皮提取物的總?cè)坪繙y定
分別吸取熊果酸標準溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL(相當于熊果酸0～58.5 μg)置于10 mL比色管中， 60 ℃水浴蒸干后加入0.4 mL 5%香草醛-冰醋酸，混勻，然后加1 mL高氯酸，混勻，在60 ℃水浴中加熱15 min后移入冰浴中冷卻，加入5 mL冰醋酸，充分混勻，于548 nm處測定并記錄吸光度值，以熊果酸質(zhì)量(μg)為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線。
準確稱取0.05 g樹皮乙醇提取物粉末，用30 mL氯仿轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，超聲波提取30 min，取出冷卻至室溫，用氯仿加至刻度，搖勻，取上清液0.5 mL置于10 mL比色管中，在60 ℃水浴蒸干，按照上述標準曲線制作操作步驟，在548 nm波長下測定樣品溶液的吸光度[15]，根據(jù)標準曲線及公式計算樣品液三萜含量。
W%=[(C×V1)/(m×V2)]×100 (1)
式中：W-樣品中三萜的質(zhì)量分數(shù)(%)； C-從標準曲線中查得樣品測定液中總?cè)频暮?μg)；V1-樣品測定液總體積(mL)；m-尾巨桉樹皮乙醇提取物的質(zhì)量(g)；V2-測定時所取的樣品測定液體積(mL)。
1.2.4 福壽螺室內(nèi)毒殺活性測定
采用藥劑浸泡法進行殺螺活性試驗[16]。稱取一定量的待測樣品，用甲醇溶解，然后用去氯水配制成50 mg/L的溶液(甲醇含量不超過2%)，以相同含量的甲醇去氯水做空白對照。用燒杯盛放200 mL藥液，每杯放入20頭幼螺，放入生菜，杯口用紗布封口以防其逃逸。實驗開始后，連續(xù)觀察和記錄2、6、24 h福壽螺的離水上爬情況，分別于處理24、48、72 h觀察和記錄福壽螺的死亡情況，計算福壽螺的上爬率和校正死亡率。
1.2.5 福壽螺頭足和肝臟中蛋白質(zhì)含量和酶活性測定
用50 mg/L的尾巨桉樹皮提取物浸泡福壽螺，另設去氯水為空白對照。分別于40 h隨機取5只活福壽螺，用去氯水洗凈，去殼取出福壽螺的頭足和肝臟部分，用吸水紙吸干福壽螺表面的水分，于-20 ℃儲存?zhèn)溆谩７謩e稱取1 g福壽螺頭足部和肝臟組織，按福壽螺組織重量1∶5的比例，加入0.2 mol/L pH7.4磷酸鹽緩沖液，用微量電動勻漿器于4 ℃勻漿，將待測組織勻漿離心分離(4 ℃，3 500 rpm，15 min)，然后取上清液采用考馬斯亮藍法測定福壽螺頭足和肝臟中蛋白質(zhì)含量，參照試劑盒說明書分別測定福壽螺頭足和肝臟中的LDH、AKP、ALT/GPT和AST/GOT酶活性。
1.2.6 數(shù)據(jù)分析
每個樣品設三次重復實驗，采用Excel 2010和SPSS19.0 進行數(shù)據(jù)處理和數(shù)據(jù)間差異分析。測定結(jié)果均以“平均值±標準誤”表示，以P<0.05為差異顯著。
2 結(jié)果與分析
2.1 干燥方式對尾巨桉樹皮乙醇提取物中三萜類物質(zhì)含量的影響
以不同體積分數(shù)(40%、60%、80%和90%)的乙醇溶液作為提取溶劑提取尾巨桉樹皮，分別采用鼓風干燥和冷凍干燥兩種方式干燥提取液浸膏，測定各組提取液中總?cè)频暮俊Ｓ蓤D1可知，不同體積分數(shù)的尾巨桉樹皮乙醇提取物中總?cè)频暮烤尸F(xiàn)顯著性差異。當乙醇體積分數(shù)到達60%時，尾巨桉樹皮提取物中總?cè)坪孔罡撸娘L干燥和冷凍干燥的樹皮提取物中總?cè)坪糠謩e達到10.81%和13.90%。因此，本實驗選取60%乙醇溶液作為尾巨桉樹皮的提取溶劑。在提取條件相同的情況下，冷凍干燥的尾巨桉樹皮乙醇提取物中總?cè)坪慷济黠@高于鼓風干燥的樹皮乙醇提取物(P<0.05)，表明冷凍干燥過程中活性成分損失少，能更好保持尾巨桉樹皮提取物中的三萜類活性物質(zhì)。
圖1 不同干燥方式的尾巨桉樹皮乙醇提取物中總?cè)坪縁ig.1 Total triterpenoids content of E.urophylla×E.grandis bark extracts drying by different methods 注：圖中小寫字母不同時，表示差異顯著(P <0.05)。Note:The data in the same column followed by different letters are significant different among treatments (P <0.05).
2.2 干燥方式對尾巨桉樹皮乙醇提取物抑制福壽螺離水上爬的影響
尾巨桉樹皮提取物抑制福壽螺離水上爬的效果見表1。尾巨桉樹皮提取物能有效抑制福壽螺離水上爬行為，鼓風干燥和冷凍干燥處理組的福壽螺上爬率均明顯低于空白對照組(P<0.05)，抑制效果均優(yōu)于同濃度下的對照藥劑茶皂素(P<0.05)。兩種干燥方式得到的樹皮提取物對福壽螺離水上爬的抑制效果差異不顯著(P>0.05)。尾巨桉樹皮提取物具有較強的抑制福壽螺逃離藥液上爬作用，這對減少藥劑使用劑量，保護環(huán)境具有非常重要的意義。
表1 尾巨桉樹皮提取物對福壽螺離水上爬率的影響
注:與空白對照組比較，*P<0.05；鼓風干燥與冷凍干燥比較，#P<0.05。表2～5同。
Note:Compared with control,*P< 0.05;Hot air drying compare with freeze drying,#P<0.05.The same with the following figure 2 to figure 5.
2.3 干燥方式對尾巨桉樹皮乙醇提取物殺螺活性的影響
表2的實驗結(jié)果表明兩種干燥方式的樹皮提取物均對福壽螺表現(xiàn)出較強的毒殺活性，與空白對照組相比殺螺效果均顯著(P<0.05)。經(jīng)鼓風干燥和冷凍干燥的樹皮提取物處理24 h后，福壽螺的死亡率都達到85.0%以上，兩者間的殺螺活性差異不顯著(P>0.05)。冷凍干燥的樹皮提取物對福壽螺72 h的毒殺活性與同濃度下的對照藥劑茶皂素一致，福壽螺死亡率均到達100.0%。
表2 尾巨桉樹皮提取物對福壽螺的毒殺活性
2.4 干燥方式對尾巨桉樹皮乙醇提取物處理后福壽螺頭足和肝臟蛋白質(zhì)含量的影響
蛋白質(zhì)是生物體最重要的組分之一，它是與生命及各種形式的生命活動緊密聯(lián)系在一起的物質(zhì)，其含量高低可以反映機體生命活動和生理功能水平。兩種干燥方式的樹皮提取物對福壽螺組織蛋白質(zhì)含量的影響見表3。與空白對照組相比，冷凍干燥的樹皮提取物能明顯降低福壽螺頭足中蛋白質(zhì)水平(P<0.05)，兩種干燥方式的樹皮提取物均能降低福壽螺肝臟中蛋白質(zhì)含量，但與空白對照比較均無顯著性差異(P>0.05)。上述結(jié)果表明經(jīng)尾巨桉樹皮提取物降低了福壽螺體內(nèi)總蛋白質(zhì)含量，可能造成其營養(yǎng)不良，進而影響其調(diào)節(jié)代謝、機體防御等特殊功能，最終導致福壽螺死亡[17]。
2.5 干燥方式對尾巨桉樹皮乙醇提取物處理后福壽螺頭足和肝臟酶活性的影響
AKP、LDH、AST/GOT和ALT/GPT為福壽螺軟體組織中重要酶，參與一系列神經(jīng)遞質(zhì)傳遞、能量代謝、蛋白質(zhì)代謝等相關的催化反應[18]。由表4和5可知，鼓風干燥和冷凍干燥的樹皮提取物均可抑制福壽螺頭足部中LDH、 AKP 和AST/GOT的活性(P<0.05)以及肝臟中ALT/GPT和AST/GOT的活性(P<0.05)。尾巨桉樹皮提取物可能通過作用于福壽螺體內(nèi)具有生物活性的酶繼而導致其死亡。LDH是無氧呼吸過程中的重要酶，經(jīng)尾巨桉樹皮提取物處理后福壽螺頭足中LDH受到抑制，表示該組織無氧呼吸的減弱，無氧能量代謝過程受到了影響[19]，而肝臟中LDH變化不大(P>0.05)。AKP與蛋白質(zhì)的合成有關[20]，在細胞膜進行主動轉(zhuǎn)運的過程中有著重要作用[21]。AST/GOT和ALT/GPT是蛋白質(zhì)代謝過程中起關鍵作用的氨基轉(zhuǎn)移酶，在三羧酸循環(huán)中起非常重要的作用[19]。經(jīng)尾巨桉樹皮提取物處理后福壽螺頭足部的AKP和AST/GOT以及肝臟中的AST/GOT和ALT/GPT活性降低，間接證明了尾巨桉樹皮提取物影響福壽螺體內(nèi)蛋白的合成。LDH、AKP、AST/GOT和ALT/GPT可能是植物源殺螺劑尾巨桉樹皮提取物的作用靶點。冷凍干燥的樹皮提取物對福壽螺頭足和肝臟中AKP和AST/GOT的抑制效果均高于鼓風干燥的樹皮提取物(P<0.05)，說明冷凍干燥有利于提高尾巨桉樹皮提取物的生物活性。
表3 尾巨桉樹皮提取物對福壽螺頭足和肝臟蛋白質(zhì)含量(40 h)的影響
表4 尾巨桉樹皮提取物對福壽螺頭足酶活性(40 h)的影響
表5 尾巨桉樹皮提取物對福壽螺肝臟酶活性(40 h)的影響
3 結(jié)論
本研究初步探討了尾巨桉樹皮在防治福壽螺方面的開發(fā)和利用價值。研究結(jié)果表明尾巨桉樹皮的乙醇提取物對福壽螺表現(xiàn)出較強的殺螺活性，能夠有效抑制福壽螺的離水上爬行為，經(jīng)尾巨桉樹皮乙醇提取物處理后福壽螺軟體組織中的蛋白質(zhì)含量及乳酸脫氫酶、堿性磷酸酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶活性均有所降低，尾巨桉樹皮有望成為新的植物源殺螺劑。與鼓風干燥相比，冷凍干燥能夠更好保持尾巨桉樹皮提取物中的活性成分(三萜類化合物)，提高其殺螺活性。綜上所述，尾巨桉樹皮來源豐富，易采集，成本低，對環(huán)境安全無污染，有利于工業(yè)化生產(chǎn)，是一種極具開發(fā)潛力的植物源殺螺劑，本研究結(jié)果將為其進一步的開發(fā)利用提供實驗室依據(jù)。
李晶晶，甘金佳，莫 玲，程 浩
1桂林醫(yī)學院公共衛(wèi)生學院，桂林 541004； 2中國科學院廣西植物研究所，桂林 541006
福壽螺Pomaceacanaliculata，原產(chǎn)于南美洲，是一種嚴重危害農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及人類健康的世界性惡性外來入侵物種，也是我國環(huán)保部公布的首批入侵我國的16種“危害最大的外來物種”之一。在我國，受到福壽螺入侵災害影響的包括我國長江以南的十幾個省區(qū)，給當?shù)氐乃竞退魑锓N植造成了巨大經(jīng)濟損失和生態(tài)災害[1,2]；同時，福壽螺還是能引起人類嗜酸性腦膜炎的廣州管圓線蟲的中間宿主，危害人類健康[3]。目前化學藥劑滅螺是最主要的控制福壽螺措施，但目前登記的殺螺藥劑極少(僅有殺螺胺類和四聚乙醛兩種)，且存在毒性大、污染環(huán)境、抗藥性以及價格昂貴等缺點[4,5]，使福壽螺防治始終是困擾人們的巨大難題。因此，尋找對環(huán)境安全、高效、低毒的天然源殺螺藥劑勢在必行。
桉樹是桃金娘科(Myrtaceae)桉屬(Eucalyptus)植物，是世界上種植面積最廣的樹種之一。桉樹皮中含有單寧[6]、三萜[7-9]、間苯三酚、黃酮類、單萜、酚酸、甾醇等化學成分[10-12]，是一種可以重復利用的生物資源。在前期研究中，我們發(fā)現(xiàn)桉樹皮提取物對福壽螺具有很強的毒殺活性，其主要的活性成分為五環(huán)三萜類化合物[8,9]，可能是一種有開發(fā)潛力的植物源殺螺藥劑，值得進一步研究其作用機理。桉樹皮作為桉樹木材加工業(yè)的主要副產(chǎn)品，資源非常巨大。桉樹在我國的種植面積已達450 hm2，年產(chǎn)木材超過3 000萬m3[13]，根據(jù)桉樹皮產(chǎn)量為原木產(chǎn)量的11%計算[14]，年產(chǎn)桉樹皮約330萬m3。目前，我國絕大部分桉樹皮通常被直接丟棄，其中的活性物質(zhì)沒有得到充分利用造成了巨大的浪費。
目前對于桉樹皮的研究主要集中在其化學成分及抗氧化、抑菌活性方面，在農(nóng)藥領域的應用僅有我們研究團隊進行了少量研究，總體來說，桉樹皮資源尚未得到充分利用。廣西是我國桉樹種植面積最大的省，尾巨桉(Eucalyptusurophylla×Eucalyptusgrandis)是廣西目前主要種植的桉樹樹種，目前有關尾巨桉樹皮對福壽螺的毒殺活性及作用機理的研究尚未見報道。本研究主要考察不同干燥方式和乙醇提取濃度對桉樹皮乙醇提取物中總?cè)坪亢蜌⒙莼钚缘挠绊懀y定經(jīng)桉樹皮乙醇提取物處理后福壽螺頭足部、肝臟中蛋白質(zhì)含量及酶活性的變化，初步探討其殺螺作用機理，以期為桉樹皮在農(nóng)藥領域的開發(fā)應用提供實驗室基礎。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料
新鮮剝落尾巨桉E.urophylla×E.grandis樹皮采自廣西柳州鹿寨縣黃冕林場，由廣西壯族自治區(qū)中國科學院廣西植物研究所姚月鋒副研究員鑒定。
1.1.2 供試軟體動物
福壽螺Pomaceacanaliculata幼螺采自桂林市農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)場水稻田溝邊，于實驗室飼養(yǎng)7天后，選用大小一致、無損傷的幼螺供室內(nèi)試驗。
1.1.3 主要儀器和試劑
FE-130植物粉碎機(河北黃曄科學儀器廠)，EYELA-1型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(日本Tokyo Rikakikai公司)，101A-1E型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海實驗儀器有限公司)，F(xiàn)E-1CE型多歧管冷凍干燥機(博醫(yī)康科技公司)，LUX型多功能性酶標儀(美國Thermo Fisher Scientific 公司)，Biomate3S型紫外可見光分光光度儀 (美國Thermo Fisher Scientific 公司)。茶皂素原粉：中國農(nóng)科院茶葉研究所提供，含量60%。考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒、LDH(乳酸脫氫酶)試劑盒、 AKP(堿性磷酸酶)試劑盒、ALT/GPT(谷丙轉(zhuǎn)氨酶)試劑盒、AST/GOT(谷草轉(zhuǎn)氨酶)試劑盒：南京建成生物工程中心；其余試劑為國產(chǎn)分析純。
1.2 方法
1.2.1 尾巨桉樹皮乙醇提取物的制備
取新鮮剝落的尾巨桉樹皮，置于通風陰涼處陰干至水分含量為9%，粉碎后過60目篩。分別稱取200.0 g尾巨桉樹皮粉末，按料液比為1 g∶40 mL的比例，分別加入體積分數(shù)為40%、60%、80%、90%的乙醇水溶液，超聲波提取2 h(功率500 w，溫度60 ℃)，經(jīng)布氏漏斗抽濾后收集濾液。上述過程重復2次，合并濾液。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將上述濾液減壓濃縮得到樹皮乙醇提取物浸膏，置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>
1.2.2 尾巨桉樹皮乙醇提取物的干燥處理
稱取在4 ℃冰箱中保存的尾巨桉樹皮乙醇提取物浸膏，分別置于恒溫鼓風干燥箱及冷凍干燥機中干燥至恒重。鼓風干燥條件為40 ℃，干燥24 h。冷凍干燥條件為，先在-20 ℃冰箱中預凍24 h，冷阱溫度-40 ℃，真空度0.025 MPa，干燥時間約48 h。兩種不同干燥方式干燥后的樹皮乙醇提取物研磨成粉末后過篩(100目)，分別放入密封袋內(nèi)保存，用于活性成分和生物活性測定。
1.2.3 尾巨桉樹皮提取物的總?cè)坪繙y定
分別吸取熊果酸標準溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL(相當于熊果酸0～58.5 μg)置于10 mL比色管中， 60 ℃水浴蒸干后加入0.4 mL 5%香草醛-冰醋酸，混勻，然后加1 mL高氯酸，混勻，在60 ℃水浴中加熱15 min后移入冰浴中冷卻，加入5 mL冰醋酸，充分混勻，于548 nm處測定并記錄吸光度值，以熊果酸質(zhì)量(μg)為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線。
準確稱取0.05 g樹皮乙醇提取物粉末，用30 mL氯仿轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，超聲波提取30 min，取出冷卻至室溫，用氯仿加至刻度，搖勻，取上清液0.5 mL置于10 mL比色管中，在60 ℃水浴蒸干，按照上述標準曲線制作操作步驟，在548 nm波長下測定樣品溶液的吸光度[15]，根據(jù)標準曲線及公式計算樣品液三萜含量。
W%=[(C×V1)/(m×V2)]×100 (1)
式中：W-樣品中三萜的質(zhì)量分數(shù)(%)； C-從標準曲線中查得樣品測定液中總?cè)频暮?μg)；V1-樣品測定液總體積(mL)；m-尾巨桉樹皮乙醇提取物的質(zhì)量(g)；V2-測定時所取的樣品測定液體積(mL)。
1.2.4 福壽螺室內(nèi)毒殺活性測定
采用藥劑浸泡法進行殺螺活性試驗[16]。稱取一定量的待測樣品，用甲醇溶解，然后用去氯水配制成50 mg/L的溶液(甲醇含量不超過2%)，以相同含量的甲醇去氯水做空白對照。用燒杯盛放200 mL藥液，每杯放入20頭幼螺，放入生菜，杯口用紗布封口以防其逃逸。實驗開始后，連續(xù)觀察和記錄2、6、24 h福壽螺的離水上爬情況，分別于處理24、48、72 h觀察和記錄福壽螺的死亡情況，計算福壽螺的上爬率和校正死亡率。
1.2.5 福壽螺頭足和肝臟中蛋白質(zhì)含量和酶活性測定
用50 mg/L的尾巨桉樹皮提取物浸泡福壽螺，另設去氯水為空白對照。分別于40 h隨機取5只活福壽螺，用去氯水洗凈，去殼取出福壽螺的頭足和肝臟部分，用吸水紙吸干福壽螺表面的水分，于-20 ℃儲存?zhèn)溆谩７謩e稱取1 g福壽螺頭足部和肝臟組織，按福壽螺組織重量1∶5的比例，加入0.2 mol/L pH7.4磷酸鹽緩沖液，用微量電動勻漿器于4 ℃勻漿，將待測組織勻漿離心分離(4 ℃，3 500 rpm，15 min)，然后取上清液采用考馬斯亮藍法測定福壽螺頭足和肝臟中蛋白質(zhì)含量，參照試劑盒說明書分別測定福壽螺頭足和肝臟中的LDH、AKP、ALT/GPT和AST/GOT酶活性。
1.2.6 數(shù)據(jù)分析
每個樣品設三次重復實驗，采用Excel 2010和SPSS19.0 進行數(shù)據(jù)處理和數(shù)據(jù)間差異分析。測定結(jié)果均以“平均值±標準誤”表示，以P<0.05為差異顯著。
2 結(jié)果與分析
2.1 干燥方式對尾巨桉樹皮乙醇提取物中三萜類物質(zhì)含量的影響
以不同體積分數(shù)(40%、60%、80%和90%)的乙醇溶液作為提取溶劑提取尾巨桉樹皮，分別采用鼓風干燥和冷凍干燥兩種方式干燥提取液浸膏，測定各組提取液中總?cè)频暮俊Ｓ蓤D1可知，不同體積分數(shù)的尾巨桉樹皮乙醇提取物中總?cè)频暮烤尸F(xiàn)顯著性差異。當乙醇體積分數(shù)到達60%時，尾巨桉樹皮提取物中總?cè)坪孔罡撸娘L干燥和冷凍干燥的樹皮提取物中總?cè)坪糠謩e達到10.81%和13.90%。因此，本實驗選取60%乙醇溶液作為尾巨桉樹皮的提取溶劑。在提取條件相同的情況下，冷凍干燥的尾巨桉樹皮乙醇提取物中總?cè)坪慷济黠@高于鼓風干燥的樹皮乙醇提取物(P<0.05)，表明冷凍干燥過程中活性成分損失少，能更好保持尾巨桉樹皮提取物中的三萜類活性物質(zhì)。
圖1 不同干燥方式的尾巨桉樹皮乙醇提取物中總?cè)坪縁ig.1 Total triterpenoids content of E.urophylla×E.grandis bark extracts drying by different methods 注：圖中小寫字母不同時，表示差異顯著(P <0.05)。Note:The data in the same column followed by different letters are significant different among treatments (P <0.05).
2.2 干燥方式對尾巨桉樹皮乙醇提取物抑制福壽螺離水上爬的影響
尾巨桉樹皮提取物抑制福壽螺離水上爬的效果見表1。尾巨桉樹皮提取物能有效抑制福壽螺離水上爬行為，鼓風干燥和冷凍干燥處理組的福壽螺上爬率均明顯低于空白對照組(P<0.05)，抑制效果均優(yōu)于同濃度下的對照藥劑茶皂素(P<0.05)。兩種干燥方式得到的樹皮提取物對福壽螺離水上爬的抑制效果差異不顯著(P>0.05)。尾巨桉樹皮提取物具有較強的抑制福壽螺逃離藥液上爬作用，這對減少藥劑使用劑量，保護環(huán)境具有非常重要的意義。
表1 尾巨桉樹皮提取物對福壽螺離水上爬率的影響
注:與空白對照組比較，*P<0.05；鼓風干燥與冷凍干燥比較，#P<0.05。表2～5同。
Note:Compared with control,*P< 0.05;Hot air drying compare with freeze drying,#P<0.05.The same with the following figure 2 to figure 5.
2.3 干燥方式對尾巨桉樹皮乙醇提取物殺螺活性的影響
表2的實驗結(jié)果表明兩種干燥方式的樹皮提取物均對福壽螺表現(xiàn)出較強的毒殺活性，與空白對照組相比殺螺效果均顯著(P<0.05)。經(jīng)鼓風干燥和冷凍干燥的樹皮提取物處理24 h后，福壽螺的死亡率都達到85.0%以上，兩者間的殺螺活性差異不顯著(P>0.05)。冷凍干燥的樹皮提取物對福壽螺72 h的毒殺活性與同濃度下的對照藥劑茶皂素一致，福壽螺死亡率均到達100.0%。
表2 尾巨桉樹皮提取物對福壽螺的毒殺活性
2.4 干燥方式對尾巨桉樹皮乙醇提取物處理后福壽螺頭足和肝臟蛋白質(zhì)含量的影響
蛋白質(zhì)是生物體最重要的組分之一，它是與生命及各種形式的生命活動緊密聯(lián)系在一起的物質(zhì)，其含量高低可以反映機體生命活動和生理功能水平。兩種干燥方式的樹皮提取物對福壽螺組織蛋白質(zhì)含量的影響見表3。與空白對照組相比，冷凍干燥的樹皮提取物能明顯降低福壽螺頭足中蛋白質(zhì)水平(P<0.05)，兩種干燥方式的樹皮提取物均能降低福壽螺肝臟中蛋白質(zhì)含量，但與空白對照比較均無顯著性差異(P>0.05)。上述結(jié)果表明經(jīng)尾巨桉樹皮提取物降低了福壽螺體內(nèi)總蛋白質(zhì)含量，可能造成其營養(yǎng)不良，進而影響其調(diào)節(jié)代謝、機體防御等特殊功能，最終導致福壽螺死亡[17]。
2.5 干燥方式對尾巨桉樹皮乙醇提取物處理后福壽螺頭足和肝臟酶活性的影響
AKP、LDH、AST/GOT和ALT/GPT為福壽螺軟體組織中重要酶，參與一系列神經(jīng)遞質(zhì)傳遞、能量代謝、蛋白質(zhì)代謝等相關的催化反應[18]。由表4和5可知，鼓風干燥和冷凍干燥的樹皮提取物均可抑制福壽螺頭足部中LDH、 AKP 和AST/GOT的活性(P<0.05)以及肝臟中ALT/GPT和AST/GOT的活性(P<0.05)。尾巨桉樹皮提取物可能通過作用于福壽螺體內(nèi)具有生物活性的酶繼而導致其死亡。LDH是無氧呼吸過程中的重要酶，經(jīng)尾巨桉樹皮提取物處理后福壽螺頭足中LDH受到抑制，表示該組織無氧呼吸的減弱，無氧能量代謝過程受到了影響[19]，而肝臟中LDH變化不大(P>0.05)。AKP與蛋白質(zhì)的合成有關[20]，在細胞膜進行主動轉(zhuǎn)運的過程中有著重要作用[21]。AST/GOT和ALT/GPT是蛋白質(zhì)代謝過程中起關鍵作用的氨基轉(zhuǎn)移酶，在三羧酸循環(huán)中起非常重要的作用[19]。經(jīng)尾巨桉樹皮提取物處理后福壽螺頭足部的AKP和AST/GOT以及肝臟中的AST/GOT和ALT/GPT活性降低，間接證明了尾巨桉樹皮提取物影響福壽螺體內(nèi)蛋白的合成。LDH、AKP、AST/GOT和ALT/GPT可能是植物源殺螺劑尾巨桉樹皮提取物的作用靶點。冷凍干燥的樹皮提取物對福壽螺頭足和肝臟中AKP和AST/GOT的抑制效果均高于鼓風干燥的樹皮提取物(P<0.05)，說明冷凍干燥有利于提高尾巨桉樹皮提取物的生物活性。
表3 尾巨桉樹皮提取物對福壽螺頭足和肝臟蛋白質(zhì)含量(40 h)的影響
表4 尾巨桉樹皮提取物對福壽螺頭足酶活性(40 h)的影響
表5 尾巨桉樹皮提取物對福壽螺肝臟酶活性(40 h)的影響
3 結(jié)論
本研究初步探討了尾巨桉樹皮在防治福壽螺方面的開發(fā)和利用價值。研究結(jié)果表明尾巨桉樹皮的乙醇提取物對福壽螺表現(xiàn)出較強的殺螺活性，能夠有效抑制福壽螺的離水上爬行為，經(jīng)尾巨桉樹皮乙醇提取物處理后福壽螺軟體組織中的蛋白質(zhì)含量及乳酸脫氫酶、堿性磷酸酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶活性均有所降低，尾巨桉樹皮有望成為新的植物源殺螺劑。與鼓風干燥相比，冷凍干燥能夠更好保持尾巨桉樹皮提取物中的活性成分(三萜類化合物)，提高其殺螺活性。綜上所述，尾巨桉樹皮來源豐富，易采集，成本低，對環(huán)境安全無污染，有利于工業(yè)化生產(chǎn)，是一種極具開發(fā)潛力的植物源殺螺劑，本研究結(jié)果將為其進一步的開發(fā)利用提供實驗室依據(jù)。
