飛燕草素對光誘導的視網膜氧化損傷的保護作用

彭佳媛，杜旌暢，鐘 茜，劉婷婷，楊利瓊，吳藹林，陳 瑋，朱彥鋒，余小平

0引言

光污染(light pollution)廣泛存在于生活環境中，其導致的視網膜損傷已逐漸成為較嚴重的公共衛生問題[1]。研究證實，短時強光或長時弱光照射對視網膜可造成光化學損傷、熱損傷和機械損傷，其中以視網膜光化學損傷(retina photochemical damage，RPD)為主[2]。流行病學研究表明[3]，光損傷導致的視網膜疾病在未來20a將增加1倍，因而研究RPD的有效預防途徑顯得尤為迫切。花青素(anthocyanin)是一組天然黃酮類化合物，廣泛存在于有色蔬果中，具有多種生物活性，包括抗氧化[4-5]、抗炎[6-7]、抑癌[8]和神經保護[9]作用。花青素主要有6種單體，即飛燕草素(delphinidin，Dp)、花葵素(pelargonidin)、錦葵花素(malvidin)、矢車菊素(cyanidin)、芍藥花青素(peonidin)、矮牽牛素(petunidin)，其中以花色苷Dp豐度較高，且羥基數量較多，其抗氧化生物特性高于其它單體[10-11]。我們前期研究[12-13]證實，黑米花青素能通過抗氧化、抗凋亡途徑防護RPD，Dp是黑米花青素的主要活性成分，但是否能有效防護RPD尚不清楚。本研究以661W小鼠視網膜感光細胞和Sprague-Dawley(SD)大鼠為研究對象，從體內和體外角度探討Dp是否通過調節氧化-抗氧化系統防護RPD。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1實驗細胞和動物661W感光細胞購自上海奧陸生物有限公司(來源于美國俄克拉何馬州大學)。健康SPF級成年SD大鼠購自成都達碩實驗動物有限公司[動物生產許可證號：SCXK(川)2015-030]，體質量200±20g，飼養于SPF實驗動物屏障環境。本研究符合動物倫理學要求，經倫理委員會審批通過。

1.1.2試劑和儀器主要試劑：Dp(美國Sigma公司，Dp為不溶于水的干粉，用DMSO配制成80mmol/L母液，-80℃保存)；DMEM培養基、青霉素G、鏈霉素、胰蛋白酶(美國Hyclone公司)；胎牛血清(美國Gibco公司)；CCK-8試劑盒(日本同仁公司)；乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)檢測試劑盒(中國南京建成公司)；硫代巴比妥酸活性物質(thiobarbituric acid reactive substances，TBARS)(大鼠、小鼠)、LDH/SOD/GSH(大鼠)ELISA試劑盒(中國南京森貝伽公司)；谷胱甘肽巰基轉移酶(glutathione S-transferase，GST)試劑盒、RIPA裂解液(中國Solarbio公司)；BCA(美國Thermo公司)。主要儀器：CO2培養箱(美國Thermo Scientific公司)；細胞光照儀(自制)；CMC-01多功能光照箱(自制)；IX71倒置熒光相差顯微鏡(日本Olympus)；Power Wave XS2酶標儀(美國BioTek)；石蠟切片機(德國LEICA RM2235)。

1.2方法

1.2.1 661W細胞培養及分組661W細胞用含10%胎牛血清、青霉素G(100IU)和鏈霉素(100μg/mL)的高糖DMEM培養基常規培養，每3～4d用胰蛋白酶消化傳代1次，收集對數生長期的細胞進行分組處理。(1)正常對照組：置于37℃、5% CO2培養箱中避光培養24h更換新培養基，繼續保持原條件培養24h；(2)光照處理組：置于37℃、5% CO2培養箱中，2 000Lx強度白色熒光持續光照24h，更換新培養基，繼續保持原條件光照24h；(3)Dp處理組：置于37℃、5% CO2培養箱中，2 000Lx強度白色熒光持續光照24h，將Dp處理組的3組細胞分別更換為含5、10、20μmol/L濃度Dp的培養基，繼續光照24h[9，14]。

1.2.2 CCK-8法檢測細胞活性收集對數生長期的細胞，根據實驗分組接種細胞至96孔培養板，每孔加入200μL細胞懸液(5×104個/mL)。根據各組處理方法處理細胞后參考CCK-8試劑盒說明書，每孔加入新鮮配置的CCK-8溶液(培養基總體積的10%)，同時設3個空白復孔，繼續培養2h后在酶標儀450nm波長處測定光吸收值。

1.2.3細胞LDH、TBARS、SOD、GSH-Px、GST含量或活力測定制備處于對數期的661W細胞懸液(2×106個/mL)，分別接種于5個T75培養瓶中，每瓶8mL，于37℃、5% CO2培養箱中培養24h。根據各組處理方法處理細胞后，于顯微鏡下觀察細胞形態，收集各組細胞上清液，-80℃保存，BCA法測定蛋白濃度，按LDH試劑盒說明書檢測其活力。然后收集細胞，低溫離心，超聲粉碎，低溫提取蛋白，BCA法檢測蛋白濃度，嚴格按照TBARS、SOD、GSH-Px、GST試劑盒說明書檢測TBARS含量以及抗氧化酶系(SOD、GSH-Px、GST)活性。

圖1 Dp對光損傷后細胞活性的影響 bP<0.01 vs光照處理組。

1.2.4 RPD動物模型的建立和分組將60只SD大鼠隨機分為正常對照組、光照組和Dp處理組，每組各20只。對照組大鼠常規飼養30d；光照組大鼠常規飼養29d后以3 000Lx光照處理24h；Dp處理組大鼠先以Dp[100mg/(kg·d)]每日一次灌胃給藥28d，停藥暗適應24h后以3 000Lx光照處理24h[12-13]。

1.2.5大鼠視網膜形態學觀察脫頸椎處死大鼠后摘取左側眼球，用預冷的生理鹽水洗去浮血，濾紙吸干后置于4%多聚甲醛中固定2h，常規脫水，浸蠟、石蠟包埋，經視神經矢狀縱切，制成厚度5μm的切片。石蠟切片常規脫蠟至水，0.01mmol/L PBS緩沖液漂洗1次，5min；蘇木精染色5min，自來水沖洗1min；1%鹽酸-70%乙醇分色30s，自來水沖洗或浸泡30min至切片變藍色；1%伊紅溶液染色10min。梯度乙醇脫水：75%乙醇1min，85%乙醇3min，95%乙醇7min，100%乙醇Ⅰ 10min，100%乙醇Ⅱ 10min。二甲苯透明：二甲苯Ⅰ 20min，二甲苯Ⅱ 20min。中性樹膠封片，晾干，于倒置光學顯微鏡下觀察視網膜形態。

1.2.6抗氧化指標檢測脫頸椎處死大鼠后摘取右側眼球，用預冷的生理鹽水洗去浮血，濾紙吸干后，剝取視網膜，置于預冷的細胞裂解液機械勻漿，4℃下3 000r/min離心10min。提取視網膜組織蛋白，BCA法檢測蛋白含量。按南京森貝伽公司ELISA試劑盒說明書檢測各組大鼠視網膜TBARS、SOD、GSH-Px、GST含量。

2結果

2.1 Dp對光損傷后細胞活性的影響CCK-8法檢測結果顯示，正常對照組、光照處理組、Dp處理組(5、10、20μmol/L濃度Dp)細胞活性(OD值)分別為3.280±0.075、1.690±0.201、3.405±0.168、3.398±0.360、2.587±0.012，差異有統計學意義(F=40.092，P<0.001)。與正常對照組相比，光照處理組細胞活性明顯下降(P<0.01)；與光照處理組比較，Dp處理組細胞活性均明顯升高(P<0.01)，且呈劑量相關性(圖1)。

圖2 Dp對光損傷后細胞形態的影響(×100) A：正常對照組：細胞生長旺盛，排列緊密；B：光照處理組，細胞皺縮，大量脫落；C：5μmol/L Dp處理組：細胞脫落較少；D：10μmol/L Dp處理組：細胞脫落較少；E：20μmol/L Dp處理組：細胞脫落較多。箭頭所指為死亡細胞。

圖3 Dp對光損傷后細胞LDH、TBARS、SOD、GSH-Px、GST的影響 A：LDH；B：TBARS；C：SOD；D：GSH-Px；E：GST。aP<0.05，bP<0.01 vs 光照處理組。

表1 Dp對光損傷后細胞LDH、TBARS、SOD、GSH-Px、GST的影響

2.2 Dp對光損傷后細胞形態的影響倒置顯微鏡下觀察，正常對照組細胞生長良好。光照48h后細胞大量脫落、死亡，懸浮于培養基中，且存活細胞的胞壁出現皺縮，貼壁生長能力降低。不同濃度Dp處理組細胞的數量和貼壁能力明顯較光照處理組升高，且該升高趨勢呈現Dp劑量相關性(圖2)。

2.3 Dp對光損傷后細胞LDH、TBARS、SOD、GSH-Px、GST的影響正常對照組、光照處理組、Dp處理組(5、10、20μmol/L濃度Dp)細胞LDH活力、TBARS含量及SOD、GSH-Px、GST活性差異均有統計學意義(P<0.001，表1)。光照處理組細胞LDH活力較正常對照組明顯增高(P<0.01)，而Dp處理組細胞LDH活力均較光照處理組顯著降低(P<0.01)，且呈劑量相關性。與正常對照組相比，光照處理組細胞TBARS含量明顯升高，SOD、GSH-Px、GST活力均明顯降低(P<0.01)，經不同濃度Dp處理后，各組細胞TBARS含量均降低；SOD、GSH-Px、GST活性均升高(P<0.01)，且具有劑量依賴性(圖3)。

2.4各組大鼠視網膜形態學結構倒置光學顯微鏡下觀察各組大鼠視網膜結構發現，光照損傷會導致大鼠視網膜外核層細胞間隙增大，光感受器細胞結構紊亂，外核層厚度變薄，而Dp可保護大鼠視網膜結構(圖4)。

2.5各組大鼠視網膜組織TBARS、SOD、GSH-Px、GST變化正常對照組、Dp處理組、光照處理組的大鼠視網膜組織中TBARS、SOD、GSH-Px、GST含量差異均有統計學意義(P<0.001，表2)。與正常對照組相比，光照處理組的大鼠視網膜組織中TBARS含量上升，SOD、GSH-Px、GST含量均下降(P<0.01)；與光照處理組相比，Dp處理組的大鼠視網膜組織中TBARS含量下降，SOD、GSH-Px、GST含量均升高(P<0.01，圖5)。

圖4 各組大鼠視網膜形態學結構(A～C×200，D～F×400) A、D：正常對照組，外核層中感光細胞致密、排列有序；B、E：Dp處理組，外核層中感光細胞排列較為有序，細胞數量較多；C、F：光照處理組，外核層中感光細胞排列松散，細胞數量減少，外核層厚度變薄。箭頭所示為大鼠視網膜外核層。

圖5 各組大鼠視網膜組織TBARS、SOD、GSH-Px、GST變化 A：TBARS；B：SOD；C:GSH-Px；D：GST。bP<0.01 vs 光照處理組。

表2 各組大鼠視網膜組織TBARS、SOD、GSH-Px、GST變化

3討論

視覺的形成需要一定光量刺激視網膜，視網膜病變尤其是視錐細胞損傷會導致夜盲和視野縮窄，最終導致中心視力嚴重受損，然而視錐細胞繼發損傷的病理機制卻仍未明確。近年來，本課題組[12-13]及其他研究[2，15]均證實，在3 000Lx連續光照下，視紫紅質可吸收過量光子產生較多自由基，進而使膜結構(盤膜、線粒體膜、核膜及內質網膜)中的脂類發生過氧化連鎖反應，形成脂質過氧化物和活性氧介質(reactive oxygen intermediate，ROI)，組織內過氧化產物累積會導致視錐細胞發生氧化應激損傷。本研究中過度光照導致661W細胞形態發生改變，CCK-8檢測結果表明，細胞活力明顯下降，并釋放大量LDH，與陳勝等[16]和Zhou等[17]研究結果一致，說明過度光照會抑制細胞活力，誘導細胞受損。光照后661W細胞和大鼠視網膜組織中脂質過氧化TBARS明顯上調，與Izawa等[18]采用小鼠構建RPD模型后檢測視網膜組織中TBARS結果相似，表明過度光照會導致視網膜組織中TBARS含量增加。SOD、GSH-Px、GST是體內重要的抗氧化酶系，對機體的氧化與抗氧化平衡起到至關重要的作用[19-20]。本研究發現，光照后661W細胞和大鼠視網膜組織中抗氧化酶系(SOD、GSH-Px、GST)活性降低，說明光照促使視網膜細胞氧化應激水平升高，打破視網膜中氧化-抗氧化系統平衡，損傷感光細胞形態，長期光損傷可導致視網膜光感受器丟失，是視網膜變性發生和發展的高危因素。

氧化應激不是視網膜功能障礙和變性發展的唯一因素，其它因素如炎癥、血管改變和細胞變性等也是導致視網膜疾病發生發展的主要因素，但減少氧化應激已被公認為是視網膜疾病的有效的姑息治療方法。黃體酮、硫辛酸(lipoic acid，LA)和蘿卜硫素(sulforaphane，SFN)是常用的臨床前研究該類疾病的抗氧化劑。黃體酮可減少自由基引起的損傷[21]，增加抗氧化酶SOD的表達[22]，還可通過清除細胞內自由基減少脂質過氧化，抑制氧化應激[23]；LA是親水親脂分子，其能在水和脂質環境中發揮抗氧化和抗炎作用[24]。視網膜光損傷的體內研究證實，SFN能促進核因子NF-E2相關因子(nuclearfactor erythroidderived 2-like 2，Nrf2)和硫氧還蛋白-1(thioredoxin-1，Trx1)的表達，具有抗Caspase活性，抑制氧化后炎癥反應的作用[25]。

目前，關于視網膜功能障礙治療的研究中使用的抗氧化劑種類頗多，但均未涉及天然化合物花色苷。Dp被認為是花青素中的一種高效抗氧化劑[26-27]。新近研究發現，Dp能通過抗活性氧(reactive oxygen species，ROS)依賴性的氧化應激反應保護骨髓源性肝干細胞(BDHSCs)[28]。Ogawa等[14]也發現，Dp能顯著減少光損傷后661W細胞中ROS含量。本研究發現，在光照后的661W細胞中加入不同濃度的Dp處理24h，鏡下觀察和CCK-8檢測結果顯示，細胞的數量和活性明顯升高，且該升高趨勢呈現Dp劑量相關性(尤其在5～10μmol/L升高明顯)；661W細胞釋放出的LDH檢測結果中，Dp明顯降低了LDH活性，呈劑量相關性(5μmol/L降低效果最明顯)，說明Dp具有抗光誘導的661W細胞損傷的作用。另外，我們還發現Dp處理后，細胞內過氧化物產物TBARS在Dp濃度為10～20μmol/L內下降明顯，抗氧化酶體系(SOD、GSH-Px、GST)活性均在Dp濃度為5μmol/L升高明顯，動物實驗進一步證實Dp能通過調節氧化-抗氧化系統防護RPD，與課題組前期研究動物體內花青素防護RPD結果一致[12-13]。此外，課題組前期體內實驗發現花青素能夠升高核因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)活性，同時降低Caspase-1表達，抑制感光細胞凋亡，Dp是否具備同樣的功效，值得我們進一步探討。

綜上所述，本研究通過構建RPD的體外細胞模型和體內動物模型發現，Dp可以降低光損傷后細胞內過氧化物產物TBARS含量，提高抗氧化酶系(SOD、GSH-Px、GST)活性，說明Dp對光誘導的視網膜的氧化應激損傷具有防護作用，為研究與光感受器細胞氧化損傷相關的視網膜疾病的發病機制和植物化學藥物調控眼科疾病的研究提供了實驗依據。