LCA2型基因治療臨床試驗研究進展

趙儒意，羅學廷，譚 薇

0引言

Leber先天性黑矇(LCA)是一種遺傳性致盲性眼病，其特征是在幼年時期出現(xiàn)嚴重的視力喪失和視細胞的退行性變[1-2]。其中LCA2是由視網(wǎng)膜色素上皮特異性65kD蛋白基因(RPE65)突變引起，約占所有LCA的6%[3]。RPE65在視網(wǎng)膜色素上皮細胞中表達并編碼65kD蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)是視循環(huán)的關(guān)鍵組分[4]，缺乏功能性RPE65將導(dǎo)致11-順式視黃醛缺乏，使得視桿細胞不能產(chǎn)生光化學反應(yīng)。早期視錐細胞可通過替代途徑獲得11-順式-視黃醛[4-5]，故患有LCA的患者早期可依靠視錐細胞代償獲得視力，但隨著視錐細胞的進行性退化最終也會導(dǎo)致視功能的喪失。

在動物模型基因治療的安全性、有效性被證實的基礎(chǔ)上[6-9]，費城兒童醫(yī)院(CHOP)、倫敦大學學院(UCL)、佛羅里達大學(UF)三個研究團隊分別對RPE65突變患者開展了基因治療臨床試驗，治療均采用將攜帶有野生型RPE65序列的載體注射于視網(wǎng)膜下，研究方案的區(qū)別主要在于載體設(shè)計、注射體積、部位和結(jié)果測量方法，在3個團隊的Ⅰ～Ⅱ期研究中均顯示了RPE65基因治療的有效性。并且由CHOP研究團隊進行的一項具有里程碑意義的Ⅲ期試驗顯示基因治療后患者的multi-luminance mobility testing(MLMT)和光敏感度閾值得到改善[10]，而該治療藥物也于2017年獲得了美國FDA批準用于RPE65突變的患者，這是第一個被批準運用于人眼的基因產(chǎn)品(Voretigeneneparvovec，Luxturna)；上述結(jié)果表明人類LCA2基因治療已經(jīng)趨于成熟。然而3個團隊治療效果的差異性表明LCA2基因治療進入臨床仍有很多問題有待解決，本綜述對上訴LCA2基因治療的臨床試驗進行了回顧，著重對基因治療的注射劑型、劑量、注射方式、治療效果與年齡的相關(guān)性和治療效果的穩(wěn)定性長期性等進行概述及討論，以對LCA2基因治療進入我國臨床治療提供更多的參考和治療經(jīng)驗。

表1 三組中AAV2/2.RPE65的載體設(shè)計

1 LCA臨床試驗相關(guān)總結(jié)

1.1劑型在3個團隊的研究中，所用載體均為AAV2，為了提高基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，研究人員在病毒載體與目的基因裝配上進行了一些修改(表1)。UCL團隊在目的基因前插入了RPE65特異啟動子[11-12]，其主要針對RPE細胞進行表達。其他兩個團隊用的是CBA啟動子[13-14]。但沒有相應(yīng)的并列實驗來比較其人體試驗中轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄、翻譯強度或免疫反應(yīng)性等。

1.2劑量效應(yīng)與劑量毒性在Ⅰ期治療成功的基礎(chǔ)上[11,13-14]，3個團隊分別進行了劑量遞增試驗以探索不同劑量下的療效性與毒性。UF團隊進行的兩項研中，一項研究將15例患者分為5個劑量組[15]，另一項研究將12例患者分為低劑量和高劑量2組[16]。CHOP團隊將12例患者分為低劑量、中等劑量和高劑量3組[17]。兩個團隊的研究均未顯示出明顯的劑量效應(yīng)和劑量毒性[15-17]。UCL團隊的研究將12例患者分為低劑量和高劑量2組，在該研究中高劑量組同樣未顯示出更好的視網(wǎng)膜功能改善，但和上訴研究不同高劑量組中有5例患者發(fā)生了輕度的眼內(nèi)炎或免疫反應(yīng)，1例患者發(fā)生了輕度葡萄膜炎[12]。

由上可見更高的劑量并不能帶來更好的視網(wǎng)膜功能改善，雖然治療效果還與載體濃度、注射方式、突變類型、患者年齡和視網(wǎng)膜變性的程度等有關(guān)。并且在高劑量條件下出現(xiàn)的毒性作用提示應(yīng)該通過提高載體轉(zhuǎn)染效率來更安全地提供RPE65，但除此之外還需要更多的研究以確定基因治療載體的長期表達是否發(fā)揮劑量依賴性毒性或不良反應(yīng)，以及如何在最大化治療效果下達到最小化毒性風險。

1.3注射方式目前LCA2基因治療采用視網(wǎng)膜下注射的方式遞送載體，注射方式的不同主要是涉及注射部位以及視網(wǎng)膜下囊泡覆蓋的位置。在3個Ⅰ期試驗中[11,13-14]，9例患者有6例的視網(wǎng)膜下囊泡覆蓋了黃斑區(qū)，其中2例患者的注射部位靠近中心凹附近(距離中心凹1～1.5mm范圍內(nèi))，這6例患者有4例的視網(wǎng)膜功能得到不同程度的改善，但注射部位靠近中心凹的這2例患者，1例患者發(fā)生了黃斑裂孔[13]，1例患者的黃斑中心凹厚度變薄[14]。隨后的Ⅰ～Ⅱ期試驗中共有51例參與者[12,15-17]，其中有29例的視網(wǎng)膜下囊泡覆蓋了黃斑區(qū)，多數(shù)患者表現(xiàn)出視網(wǎng)膜功能的改善，但也有患者出現(xiàn)視力下降[12,16]；且在UF團隊的研究中治療后視力增加的4例兒童有3例的視網(wǎng)膜下囊泡并未覆蓋黃斑區(qū)[16]。

在既往研究中視網(wǎng)膜敏感性改善部位幾乎都是與囊泡的位置所對應(yīng)的[11,13,15-19]，但視力改善是否與注射位于中心凹或覆蓋中心凹有關(guān)尚不明確。目前對于視網(wǎng)膜下注射是否能位于中心凹仍然有爭議，在一些實驗中顯示了支持的數(shù)據(jù)[20-22]，但對于本身視力較低的患者中心凹附近的注射在多個臨床研究中出現(xiàn)了不良事件[12-15,17,23]，并且即使在正常視網(wǎng)膜中，脫離的中心凹視網(wǎng)膜解剖復(fù)位后，中心凹視力也不能完全恢復(fù)[24-25]。對此有學者提出了一些改進方案：如注射部位可位于有功能受限但具有活力的視網(wǎng)膜區(qū)域進行[18]，或增加注射次數(shù)以便在既定劑量下達到最大化治療面積[26]。

基因治療的患者通常是年輕的，有晶狀體的，沒有玻璃體后脫離的，如何避免基因治療中視網(wǎng)膜下注射導(dǎo)致的并發(fā)癥，如晶狀體損傷、白內(nèi)障加速發(fā)展、術(shù)中玻璃體皮質(zhì)切除不凈導(dǎo)致的視網(wǎng)膜牽拉或其他玻璃體視網(wǎng)膜交界面的異常等。這些都是日后LCA2基因治療需要考慮的因素，此外還需考慮術(shù)中注入空氣對結(jié)果的影響，視網(wǎng)膜下囊泡的精確軌跡，以及由退行性變長期影響的中心凹光感受器和RPE的脆弱程度。

1.4測量方法Ⅰ期試驗中，CHOP團隊使用的測量方法包括：視力、Goldmann視野、移動性測試、瞳孔光反射、眼球震顫和OCT[13]。UCL團隊使用的測量方法包括：視力、對比敏感度、色覺、視錐閃爍靈敏度、視野(微視野、Goldmann視野、明適應(yīng)及暗適應(yīng)自動靜態(tài)視野)、移動性測試、OCT和視網(wǎng)膜電圖[11]。UF團隊使用的測量方法包括：視力、OCT、全視野敏感性測試(FST)-藍光[14]。除此之外該團隊還進行了標準暗適應(yīng)及延長暗適應(yīng)的光敏感度變化檢測來評估治療對視循環(huán)的影響[18]。這些測量方法都反映了基因治療的有效性，但對于系統(tǒng)的評價仍較欠缺，在隨后的研究中各團隊逐步對其評價方法進行了完善。UCL團隊后續(xù)增加了光譜靈敏度檢測[12]。UF團隊增加了視野(Goldmann動態(tài)視野、暗適應(yīng)靜態(tài)視野)、移動性測試、瞳孔光反射、固視檢測和FST-紅光檢測[15]。并且還著重對視力、視敏度改善范圍、OCT中外核層的厚度進行跟蹤隨訪[27]。相比全視網(wǎng)膜厚度、外核層厚度能更清楚地顯示光感受器變性的程度。CHOP團隊隨后增加了FST-白光和視網(wǎng)膜電圖檢測[17]。并且在后續(xù)I期試驗中還同時進行了白光、藍光以及紅光的FST檢測來顯示視桿和視錐光感受器靈敏度，另外還進行了功能性MRI(fMRI)來反映視皮質(zhì)的激活變化[19]。在最后的Ⅲ期試驗進一步增加了靜態(tài)視野檢測，并且還開發(fā)了一種新的移動性測試方法(MLMT)以量化參與者在不同照明環(huán)境中繞過障礙物的能力[10]。

LCA2是一種視網(wǎng)膜退行性疾病，發(fā)病最初表示為功能性的受損隨后出現(xiàn)結(jié)構(gòu)性的破壞[28]，并且不同的光感受器受損程度不同，不同的疾病階段對不同的檢測方法敏感性也不同。在目前檢測方法中結(jié)構(gòu)性檢測主要是OCT，其他檢測主要是功能性的檢測。如何對不同患者的治療效果進行規(guī)范、客觀、準確、長期、高效以及有針對性的評價也應(yīng)該納入日后人們進行研究的范圍內(nèi)。

1.5治療效果的年齡/病程依賴性雖然在一些動物研究中顯示，治療在病程的早期和晚期都可能有效[29-31]，但是在基因治療進入人體試驗后結(jié)果卻并非那么可喜，雖然有研究顯示治療效果并不與年齡成正相關(guān)[12,15]，但更多的研究顯示年輕的患者治療效果更好[16-17,19]。這種年齡與治療效果之間的關(guān)系在一項研究年齡對病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)效率影響的研究中得到部分解釋[32]。除此之外，疾病的進展也影響平均轉(zhuǎn)導(dǎo)效率[33]，然而年齡大小不能完全代表疾病的嚴重程度[28]，因此可能需要進一步研究疾病的最佳治療狀態(tài)，并制定個性化的治療方案。

1.6治療效果的長期性和穩(wěn)定性在最初的Ⅰ/Ⅱ期試驗顯示治療有效[15,17,23,34]的基礎(chǔ)上，三個團隊分別進行了長期隨訪研究。CHOP團隊進行的試驗顯示其改善的視網(wǎng)膜敏感性可持續(xù)至第3a，研究者推測可能是由于該試驗中使用了更強的啟動子[19]。而UCL和UF團隊的研究顯示視網(wǎng)膜敏感性的改善在治療1～3a后均逐漸下降[12,27]，且多項研究顯示視網(wǎng)膜變性仍在繼續(xù)[12,27,35-36]。

治療效果的有效性和長期性是包括LCA2在內(nèi)的眼部疾病基因治療的主要問題。人類試驗中治療效果不能長期維持的原因可能如下：(1)低效的轉(zhuǎn)導(dǎo)：對此可能需要更高水平的RPE65，或在疾病后期進行維持治療[9]。(2)介入治療時的疾病狀態(tài)[36-37]；最近一項研究顯示下調(diào)糖酵解酶的轉(zhuǎn)錄抑制因子(sirt6)可挽救PDE6突變的視網(wǎng)膜色素變性患者的視桿細胞，表明基因治療聯(lián)合抑制細胞凋亡的途徑可能延長治療的有效期[38]，但這只能緩解疾病的發(fā)展對于疾病晚期光遺傳學[39]或干細胞移植[40-41]可能更有效。(3)靶細胞存在非細胞自主死亡[42-43]，為此基因治療可能需同時聯(lián)合神經(jīng)保護性治療[42,44]或藥物干預(yù)措施[45-46]。

2展望

雖然目前LCA2的基因治療取得了巨大的成功，但隨著LCA基因治療進入臨床階段，如何規(guī)范化地進行基因治療是需要立即解決的問題，并且由于LCA患者其年齡、RPE細胞、感光細胞變性的區(qū)域、程度及進展不盡相同，如何針對不同患者進行個性化的基因治療，如注射部位與黃斑中心凹之間的關(guān)系、如何根據(jù)患者不同的疾病階段將基因治療聯(lián)合不同的輔助治療如神經(jīng)保護治療、抗細胞凋亡、細胞移植以及如何進行高效的系統(tǒng)性評價等是需要進一步深入研究的課題。