楊梅糖基轉移酶UGT71AN1的克隆與功能鑒定

唐銘袈，楊燕，王宇，劉忞之，王偉

楊梅糖基轉移酶UGT71AN1的克隆與功能鑒定

唐銘袈，楊燕，王宇，劉忞之，王偉

100050 北京，中國醫學科學院北京協和醫學院藥物研究所天然藥物活性物質與功能國家重點實驗室/國家衛生健康委員會天然藥物生物合成重點實驗室

從楊梅中分離鑒定糖基轉移酶基因，進行其生物催化特性研究并應用于天然產物的糖基化修飾。

利用轉錄組測序分析從楊梅葉片中獲得編碼糖基轉移酶的 Unigenes，再結合 RT-PCR 方法克隆獲得該目標基因的 cDNA，然后構建表達載體并在大腸桿菌中進行異源表達，利用體外的酶促反應進行其生物催化活性研究。

從楊梅葉片中提取總 RNA，經轉錄組高通量測序和生物信息學分析獲得編碼糖基轉移酶 UGT71AN1 基因；利用大腸桿菌進行異源表達并純化獲得融合蛋白，該酶能催化槲皮素、山奈酚、紫鉚因、棕矢車菊素、原花青素和圣草酚等黃酮類化合物合成相應的葡萄糖苷；利用質譜和 NMR 對合成的糖苷進行結構鑒定，確定了槲皮素-3'-O-葡萄糖的糖苷鍵結構。

克隆獲得一個具有催化黃酮類化合物形成葡萄糖苷的糖基轉移酶基因，可利用酶促或全細胞生物催化進行黃酮類天然產物的糖基化結構修飾。

糖基轉移酶類； 楊梅屬； 生物催化； 黃酮糖苷

糖基化反應是天然產物生物合成過程中的一個重要修飾反應，結合羥基化、酰基化和甲基化反應形成植物次生代謝產物的多樣性和復雜性。糖基化修飾能改善天然藥物的成藥性，尤其能增強其水溶性和穩定性。糖苷的形成是由糖基轉移酶催化活化的核苷二磷酸單糖到不同的苷元，糖受體包括酚類、萜類、氰醇和生物堿在內所有類型的次生代謝產物[1-3]。雖然化學合成法可實現不同苷元受體的糖基化，但化學反應條件通常較為苛刻，需要保護和脫保護等多步反應，很難實現特定位置的糖基化修飾。隨著高通量測序技術的發展，近年來植物轉錄組測序得到快速發展，極大地促進植物功能基因的克隆和功能鑒定。目前已有很多糖基轉移酶得以功能鑒定，并建立了酶促反應和全細胞水平的生物催化體系并用于天然藥物的結構修飾研究[4-7]。

糖基轉移酶具有良好的區域或位置選擇性（regio-selectivity）和立體選擇性（stereo- selectivity）[8-9]，這一催化特性是實現特定位置的糖基化修飾的優勢，但對含有多個可修飾位點的天然藥物（尤其是含有多羥基的黃酮類化合物）實現不同羥基多樣化的糖基化修飾而言也存在很大的不足，針對每個糖基化位點需要具有特定區域選擇性的糖基轉移酶。不僅如此，即使具有相同位置選擇性的糖基轉移酶，也呈現出不同的催化活性[10]。因此，為促進天然藥物的糖基化修飾研究，需要分離鑒定功能多樣的糖基轉移酶基因。

楊梅（）具有很高的藥用和食用價值，具有多種活性化合物如黃酮、酚類、有機酸、三萜等[11]，黃酮類化合物主要有槲皮素、楊梅素、山奈酚和花青素等[11]，已有的研究結果表明楊梅提取物的生物活性具有多種臨床應用價值，如抗氧化、鎮痛、抗癌、抗炎和抗高血脂[12]。楊梅中黃酮類化合物活性成分雖然具有多種藥理活性[13-14]，但開發成藥時受限于溶解度低，極大地阻礙了其制劑的開發與應用。黃酮類化合物在楊梅中大部分以糖苷形式存在，如楊梅素-3-O-鼠李糖苷（楊梅苷）、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-蕓香苷（蘆丁）等[11]，而對于不同糖苷的化學提取純化步驟繁瑣，反應條件劇烈，產物回收率低。為利用生物催化技術進行楊梅中糖苷類化合物的合成，需要從楊梅中挖掘具有功能的糖基轉移酶基因，但到目前為止還未有從楊梅中鑒定到有功能的糖基轉移酶的研究報道。本研究利用轉錄組分析從楊梅中獲得編碼糖基轉移酶的 Unigene，然后在大腸桿菌中進行異源表達并對其催化活性進行功能鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 大腸桿菌DH10B 用于質粒載體的構建和制備；（DE3）用作融合蛋白的表達宿主。

1.1.2 儀器和試劑 Trizol 試劑和一步法逆轉錄酶 PCR 試劑盒均購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 楊梅葉片 RNA 的提取及 cDNA 合成 取–80 ℃冰箱冷藏的楊梅葉片經液氮速凍充分研磨后，按照 Trizol 試劑操作手冊方法提取總 RNA。測定總 RNA 的濃度和純度，260/280介于 1.8 ~ 2.2，說明提取的 RNA 無蛋白和 DNA 污染。委托上海美吉生物醫藥科技有限公司進行轉錄組測序和數據分析，參照一步法逆轉錄酶 PCR 試劑盒說明書合成 cDNA，用作糖基轉移酶的候選基因克隆模板。

1.2.2 楊梅中糖基轉移酶基因的克隆 根據楊梅轉錄組數據分析結果，選取候選糖基轉移酶基因 Unigene 設計特異性引物用于候選糖基轉移酶全長基因 cDNA 的克隆，引物設計如表 1 所示。用引物 UGT71AN1-5 進行 RNA 反轉錄合成 cDNA，RT-PCR 反應體系含有KAPA HIFI HotstartReady Mix 溶液 25 μl，引物 UGT71AN1-1 和UGT71AN1-4（10 μmol/L）各 2 μl，cDNA 模板1 μl，用 ddH2O 補足至 50 μl。反應程序為預變性 94 ℃ 5 min；變性 94 ℃ 50 s；退火 50 ℃ 1 min，延伸 72 ℃ 1 min 30 s，運行 30 個循環；延伸 72 ℃ 10 min。再以第一輪 PCR 產物為模板，使用引物UGT71AN1-2 和 UGT71AN1-3 進行第 2 輪 PCR擴增，然后把擴增的 DNA 片段亞克隆到大腸桿菌表達載體 pTWIN1B（在表達載體 pTWIN1 基礎上進行多克隆位點的修飾）[10]，利用菌落 PCR 方法篩選正確的陽性克隆進行 DNA 測序驗證。

1.2.3 楊梅中糖基轉移酶基因的生物信息學分析 利用NCBI 分析工具 BLASTP 進行所克隆編碼基因衍生的氨基酸序列一致性分析，下載相關的具有同源性和功能鑒定的糖基轉移酶氨基酸序列，蛋白序列由 Clustal W 比對，使用 MEGA 6.0 軟件構建 Neighbor-joining 系統進化樹。系統進化分析的結果為后續進一步研究糖基轉移酶的功能機制提供了理論基礎。

1.2.4 糖基轉移酶在大腸桿菌中的重組表達和純化 將構建的重組質粒pTWIN1B-UGT71AN1 轉化表達宿主菌Transetta（DE3）中，空載體 pTWIN1B 為對照。將含重組表達載體和空載體的Transetta（DE3）菌株于 37 ℃、220 r/min 搖床培養至600= 1.0，再按照 1% 的接種量將菌液接種至 100 ml 的 LB 培養基中（含 50 mg/L 的氨芐青霉素），培養至600= 0.6 后，加入終濃度為 0.55 mmol/L 的異丙基硫代半乳糖（IPTG），在 16 ℃、165 r/min的條件下誘導培養 16 h。隨后以 8000 ×離心 10 min，收集菌體，并用 Buffer B1（20 mmol/L Na-HEPES，pH 8.5）漂洗兩次，再次充分混懸菌體。將菌體混懸液使用高壓均質機破碎 10 min，然后 12 500 ×離心 40 min，上清液即為粗酶液。

利用 IMPACTTM-TWIN 蛋白純化系統對粗酶液進行純化。將粗酶液上樣于柱體積為15 ml 的幾丁質柱進行親和層析純化，由于內含肽位于目的蛋白的 N-端，通過溫度和 pH 值（pH 6 ~ 7）改變誘導內含肽的裂解，內含肽與目的蛋白之間的肽鍵被切割，目的蛋白得以分離釋放。用 400 ml Buffer B1 清洗柱體，再用 3 倍柱體積的 Buffer B2（20 mmol/L Na-HEPES pH 6.5）沖洗柱體，溫室放置 3 d。隨后用超濾管脫鹽濃縮，通過 SDS-PAGE 鑒定純化蛋白。

1.2.5 糖基轉移酶的活性篩選 利用純化的融合蛋白 UGT71AN1 進行酶促反應，制備黃酮類糖苷的反應體系，包含 1 mmol/L 的底物、2 mmol/L UDP-Glc、1 mmol/L UGT71AN1 純酶。酶促反應在 Tris-HCl（pH 7.2）緩沖液中進行，反應總體積為 200 μl。30 ℃、220 r/min 搖床振蕩反應 12 h 后，加入 400 μl 的冰甲醇終止反應，充分混勻后離心取上清過 0.22 μm 濾膜，進而利用反相 HPLC 分析酶促反應產物，再用 HPLC分離制備少量產物進行 HR-ESI-MS 等譜學測定分析以對其結構進行鑒定。

表 1 本研究中涉及到的 PCR 引物

1.2.6 糖基轉移酶大腸桿菌工程菌的全細胞生物催化 為建立全細胞生物催化合成糖苷的催化體系，需要在工程菌DE3/pTWIN1B-中繼續轉化含有磷酸葡萄糖變位酶（phosphoglucomutase，PGM）和葡萄糖-1-磷酸焦磷酸化酶（glucose-1-phosphate uridyltransferase，galU）基因的質粒 pSLB208-Pgm-T7-GalU[10]，這兩個酶是糖基供體 UDP-葡萄糖合成關鍵酶。從轉化平板上挑取單克隆，轉接到 30 ml LB 培養基中，加入相應抗性的抗生素，37 ℃、220 r/min 振蕩培養 6 h，600= 1.0；按照 1% 的接種量接種到100 ml 的 LB培養基中，37 ℃、220 r/min 培養2 ~ 3 h 后，600= 0.6 時加入 IPTG（200 mg/ml）65 μl，16 ℃ 165 r/min 誘導培養 16 h，離心收集菌體，漂洗2 次，加入到改良后的 M9 培養基（含 10% 的葡萄糖 pH 7.0）中，調節600= 6.0；分裝菌液到反應容器中，向菌液中加入工作濃度為1 mmol/L 的槲皮素（母液濃度為 100 mmol/L，溶于 DMSO 中），每管 1 ml，每組為 3 個平行反應。30 ℃186 r/min 反應，分別于 0、2、4、6、10、12、24、36、48 h 時取樣，測定600值，將反應體系冷凍干燥，加入 1 ml 的 80% 甲醇水溶液超聲30 min，提取反應產物，12 000 r/min 離心 15 min，取上清液經 0.22 μm 的濾膜過濾，進行 HPLC 分析。產物以外標法定量，計算各時間點產物的收率。

2 結果

2.1 楊梅中糖基轉移酶基因UGT71AN1 的克隆

本研究首次對楊梅葉片進行了轉錄組測序，并且基于楊梅葉片的轉錄組分析結果，共發現 11 個功能注釋為糖基轉移酶的 Unigenes，其中 Unigene（c35900_g1_i1）被注釋為黃酮糖基轉移酶，然后采用 RT-PCR 方法直接克隆具有完整 ORF 的 cDNA，長度為 1437 bp，編碼 478 個氨基酸殘基，已在 GenBank 注冊（MK722191）并由碳水化合物活性酶數據庫（CAZy）（http://www.cazy.org/）對其功能注釋分類為 UGT71AN1 亞家族。利用 NCBI 分析工具 BLASTP 進行分析，該基因編碼的氨基酸序列與 UGT71 家族的糖基轉移酶具有較高的一致性（55.18% ~ 68.5%）；UGT71AN1 C-端具有典型的糖基轉移酶家族保守的結構域（plant secondary product glycosyltransferases，PSPG），PSPG 結構域是糖基供體與目的蛋白發生作用的主要作用區域[15]，圖 1 是針對下文系統進化分析中 32 個糖基轉移酶保守的 PSPG 結構域氨基酸殘基的統計分析。

2.2 楊梅中糖基轉移酶 UGT71AN1 的生物信息學分析

糖基轉移酶是一個多成員的基因家族，根據其氨基酸序列的同源性、催化底物性質、反應機制和三維結構，糖基轉移酶被分為 106 個家族（CAZY），從CAZY 給出的信息得知 UGT71 家族與 GT8 家族具有較近的親緣關系，而 GT8 家族的底物譜包括生物激素類、黃酮類、萜類等，推測 UGT71 家族的底物譜也可能包含這些底物。UGT71AN1 與來自其他植物 UGTs 的系統進化樹如圖 2 所示，UGT71AN1 基因與 UGT71 家族中的糖基轉移酶OAP09182（UGT71C1）、NP_001280899（UGT71K1）、D3UAG2（UGT71K2）等相似度較高，在系統進化樹中聚為一大類，歸屬為能催化黃酮多位點的糖基轉移酶，如NP_001280899（UGT71K1）和 D3UAG2（UGT71K2）能分別催化根皮素-2'-O-羥基和黃酮-4'-O-羥基的糖基化[16-17]，表明 UGT71 家族參與多種類型的次生代謝產物的糖苷化反應，并且催化底物廣泛。UGT71AN1 作為 UGT71 家族的單獨分支，也可能參與楊梅中多種活性成分的糖基化反應。

圖 1 32 個糖基轉移酶 C-端保守 PSPG 結構域

Figure 1 Weblogo of conserved PSPG motifs identified in the 32 glucosyltransferases

Figure 2 The phylogenetic tree analysis of UGT71AN1 and other plant UGT proteins by Neighbor-Joining method on MEGA 6.0 [GenBank Accession numbers of the GTs:(AFI71901, AFI71902),(OAP13716, NP_193283, NP_188793, OAP09182),(PIN26436),(ACS15351),(NP_001105886),(XP_020222524),(AHJ80981),(XP_003543752),(EXB94563),(NP_001312241),(ABL85474),(Q767C8),(B2NID7),(AHL68667),(C3W7B0),(I1L3T1),(A0A0A1HA03), Fragaria x ananassa (Q66PF4),(AAS55083),(AIF79773),(AJT58578),(NP_001280899, RXH90237),(D3UAG2),(AYR16626),(D3UAG1),(ACB88210),(MK722191)]

2.3 糖基轉移酶 UGT71AN1 的異源表達和純化

糖基轉移酶 UGT71AN1 為非分泌蛋白，利用大腸桿菌進行異源融合表達，經高壓破碎菌體后，細胞內的蛋白釋放出來，SDS-PAGE 分析結果如圖 3 所示，與對照相比，UGT71AN1 重組菌體破碎上清液在 70 ~ 100 kD 處有明顯的增強表達的蛋白條帶，說明楊梅糖基轉移酶基因在Transetta（DE3）表達宿主中可溶性的融合表達。經過親和層析純化，大小約為 20 kD 的內含肽被切割掉，洗脫純化后的 UGT71AN1 蛋白條帶大小與預期相符，約 55 kD 左右，純度達到 90% 以上。經超濾脫鹽，獲得 5 ml 純酶，質量濃度為 0.4 mg/ml。將純化后的酶與 40% 甘油以1:1 的比例保存于–80 ℃冰箱備用。

Figure 3 SDS-PAGE electrophoresis analysis of expressed UGT71AN1

2.4 糖基轉移酶的活性篩選

不同糖基轉移酶識別的受體各有不同，N-端結構域是主要的識別部位[18]，根據碳水化合物活性酶數據庫的功能注釋選取以黃酮類化合物為受體和 UDP-葡萄糖為供體，在糖基轉移酶的催化下，酶促催化合成槲皮素、山奈酚、(S)-圣草酚、異甘草素、紫鉚因和棕矢車菊素形成相應的糖苷類化合物（圖 4A）。通過 HPLC 檢測反應產物，利用反應底物和生成的糖苷產物的色譜積分初步計算相對活性，對棕矢車菊素具有最好的催化活性，其次是山奈酚、槲皮素、異甘草素、紫鉚因和 (S)-圣草酚（圖 4B）；再結合陽離子掃描質譜圖和標準品對比確認糖苷產物。

對槲皮素糖苷進行了結構鑒定：首先利用 HPLC 進行分離純化，如圖 5A 所示，UGT71AN1 反應組中底物槲皮素保留時間為 20.23 min，在保留時間為 11.88 min處有明顯單一產物峰，質譜 HR-ESI-MS 陽離子模式掃描結果 m/z 465.39 [M+H]+，487.47 [M+Na]+（圖 5B）；質譜分析結果進一步證實了 UGT71AN1 催化槲皮素形成了槲皮素-3'- O-葡萄糖苷（分子式為 C21H20O12），并經1H-NMR和13C-NMR 手段鑒定結構。

1H-NMR（500 MHz，DMSO-d）δ = 7.62（m，1H，H-2'），7.61（m，1H，H-6'），6.88（m，1H，H-5'），6.45（d，= 2.0 Hz，1H，H-8），6.24（d，= 2.0 Hz，1H，H-6），5.50（d，= 7.2 Hz，1H，H-1''），3.63（m，2H，H-5''，H-6a''），3.47-3.26（m，3H，H-2"，H-3"，H-4''），3.12（m，1H，H-6b"）。

13C-NMR（125 MHz，DMSO-d）δ = 157.3（C-2），134.2（C-3），178.4（C-4），157.1（C-5），99.6（C-6），165.1（C-7），93.2（C-8），162.2（C-9），104.9（C-10），122.6（C-1'），116.2（C-2'），145.8（C-3'），149.4（C-4'），117.1（C-5'），122.1（C-6'），101.7（C-1''），73.3（C-2''），75.8（C-3''），70.9（C-4''），77.4（C-5''），61.9（C-6''）。

2.5 槲皮素-3'-O-葡萄糖苷的全細胞催化合成

以槲皮素為受體底物，考察在 M9 培養基（含 10% 葡萄糖）中工程菌催化其合成槲皮素-3'- O-葡萄糖苷的生物催化動力學，如圖 6 所示。調整工程菌的初始菌密度600值為 6.0，于 0 h 添加 1 mmol/L 槲皮素，產物在 12 h 內迅速增加，而后12 ~ 72 h 基本保持平衡，工程菌在0 ~ 10 h 依然保持生長活性，在 48 h 時達到生長頂峰，因長時間培養過程中營養的耗盡，48 h 后呈現下降趨勢。

3 討論

天然產物具有抗病毒、抗菌、抗氧化、抗腫瘤、降血糖、降血壓以及增強免疫等生物活性。但也存在生物活性不佳、溶解度低、穩定性差或不良反應等因素使得天然產物的新藥研發難度增加并限制了其臨床應用。糖基化修飾能改變這些化學分子的活性、水溶性、穩定性，另外還能降低或消除有毒物質的毒性[1, 4, 19]。糖基轉移酶是實現糖基化修飾的一類重要催化反應，目前不僅已有功能多樣的糖基轉移酶被克隆和功能鑒定，還有酶促水平和全細胞的生物催化技術得以迅速發展和廣泛應用[6-7, 10, 19]。盡管如此，生物催化進行糖基化修飾還有很多制約因素需要深入研究，如活化的糖基供體供給、糖基轉移酶的催化活性及立體或位置選擇性問題。

為解決生物催化糖基化修飾過程中區域選擇性問題，提高催化底物活性可采用蛋白質工程對糖基轉移酶進行定向進化工程改造[6, 20-21]，但是隨著基因組、轉錄組等基因測序技術的發展，快速分離獲得具有功能多樣的糖基轉移酶依然是直接發現目標糖基轉移酶最主要的策略，不僅如此，糖基轉移酶的蛋白質工程也是基于功能鑒定的目標基因基礎之上。因此，本研究依據轉錄組測序分析結果，從楊梅中分離鑒定了第一個糖基轉移酶 UGT71AN1（GenBank：MK722191），經過在大腸桿菌中異源表達和純化獲得目標蛋白，然后在體外建立生物酶促催化反應進行功能鑒定，已通過 HPLC 和 HR-ESI-MS 分析證實了其能催化多個黃酮類化合物的糖基化，并確定了槲皮素-3'-O-葡萄糖的糖苷鍵結構。系統進化分析結果表明 UGT71AN1 與 NP_001280899（UGT71K1）和 D3UAG2（UGT71K2）具有較高的氨基酸序列一致性并聚類在一個亞家族，位置選擇性與進化聚類的結果一致[17-18]。

Figure 4 Enzymatic reaction of UGT71AN1 and relative enzymatic activities (A: Diagrammatic sketch of catalytic reaction of glycosylation reaction; B: Biotransformation of flavones into respective glucosides using the enzyme UGT71AN1)

Figure 5 Glucosylation of quercetin through enzymatic reaction and the characterization of corresponding glucoside product [A: HPLC analysis of reaction products (1: The reaction with quercetin, UDP-glucose and the purified UGT71AN1; 2: The negative reaction without the purified UGT71AN1); B: HR-ESI-MS analysis of glucoside]

圖 6 槲皮素-3'-O-葡萄糖苷全細胞生物催化動力學

Figure 6 Time course for the production of quercetin-3'-O-glucoside in engineered strain

通過對催化底物的結構對比分析，盡管山奈酚和棕矢車菊素沒有 3'-O-羥基，查爾酮類異甘草素對應的芳環上也沒有 3-O-羥基，但是 UGT71AN1 對這幾個黃酮類化合物依然都有很好的催化活性，說明該酶具有較廣泛的羥基化位點選擇性，這些糖苷的結構還需要進一步進行糖苷化產物的制備和結構鑒定。為探索其全細胞催化的可行性，我們把含有催化 UDP-葡萄糖合成的 2 個關鍵酶與 UGT71AN1 進行共誘導表達，通過外源添加槲皮素實現了槲皮素-3'-O-葡萄糖的全細胞生物催化合成。上述研究結果為從楊梅中分離鑒定更多的糖基轉移酶和把這些糖基轉移酶應用于其他黃酮類或其他天然產物的結構修飾提供了實踐借鑒。

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Identification and characterization of glucosyltransferaseUGT71AN1 from

TANG Ming-jia, YANG Yan, WANG Yu, LIU Min-zhi, WANG Wei

Author Affiliation: State Key Laboratory of Bioactive Substance and Function of Natural Medicines, Key Laboratory of Biosynthesis of Natural Products of National Health Commission of the People's Republic of China, Institute of Materia Medica, Peking Union Medical College & Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100050, China

To identify and characterize a novel glucosyltransferase from, and further test its biocatalytic regio-specificity and apply it to conduct the glycosylation modification of natural products.

Basedon the results of transcriptome analysis of, the candidate Unigene was firstly selected. A cDNA clone encoding a uridine diphosphate (UDP) glucotransferase was amplified by RT-PCR and then inserted into an expression vector pTWIN1b. It was heterologously expressed inTransetta (DE3), and its enzymatic activities was examinedby enzymatic bioconversion and whole-cell biocatalysis.

A novel gene encoding UDP-glucotransferase was cloned by RT-PCR usingcDNAs as templates according to the selected candidate Unigene sequence, based on the results of transcriptome analysis. And then it was functionally named asby the Carbohydrate-Active Enzymes Database based on the identity to the other glycosyltransferases. It was successfully expressed inTransetta (DE3) and purified. Its enzymatic activities were employed and six flavonoids such as quercetin, kaempferol, (S)-eriodictyol, isoliquiritigenin, butein, and jaceosidin were observed to be glucosylated. Their corresponding glucosides were identified by HR-ESI-MS. Among them, the glucosidic bond quercetin-3'-O-glucoside was verified by1H- and13C-NMR spectra.

The multi-function UDP-glucosyltransferase UGT71AN1 catalyzing the glucosylation of flavonoids was characterized fromleaves, and it can be further used to catalyze the glycosylation of the other flavonoids through enzymatic or whole-cell biocatalysis.

Glycosyltransferases;; Biocatalysis; Flavonoid glycosides

WANG Wei, Email: wwang@imm.ac.cn

10.3969/j.issn.1673-713X.2019.05.001

中國醫學科學院醫學與健康科技創新工程項目（2016-I2M- 3-012、2017-I2M-1-011）；“重大新藥創制”國家科技重大專項（2018ZX 09711001-006）

王偉，Email：wwang@imm.ac.cn

2019-04-23