茶園常用除草劑田間藥效試驗與殘留動態

高萬君，張永志，童蒙蒙，馬慧勤，錢珊珊，王天雨，李葉云，吳慧平*，侯如燕*

茶園常用除草劑田間藥效試驗與殘留動態

高萬君1，張永志1，童蒙蒙1，馬慧勤2，錢珊珊3，王天雨3，李葉云1，吳慧平2*，侯如燕1*

1. 安徽農業大學茶樹生物學及資源利用國家重點實驗室，安徽 合肥 230036；2. 安徽農業大學植物保護學院，安徽 合肥 230036；3. 安徽省公眾檢驗研究院有限公司，安徽 合肥 230051

對比評價了草甘膦、草銨膦、復配劑型草甘膦-乙草胺及草甘膦-助劑對茶園主要惡性雜草的防治效果，并對試驗小區土壤中各除草劑的殘留水平進行了評估。試驗結果表明，與草甘膦相比，草銨膦起效快，在施藥第7天雜草覆蓋度降低到9.15%，施藥14?d后對野老鸛、續斷菊、小飛蓬等雜草的防治效果在95%以上，草胺磷在茶園土壤中降解較快，30?d的消解率達到94%，殘留水平較低（第58天殘留量為0.01?mg·kg-1），可能是替代草甘膦除草劑的較優選擇；乙草胺作為封閉型除草劑，能夠抑制禾本科雜草出苗，且在土壤中消散較快（21?d后的消解率為97%），可用于防治禾本科等雜草。

茶園；除草劑；藥效；農藥殘留

茶樹是多年生常綠植物，栽培歷史悠久[1]。我國茶樹種植區域廣闊，茶園生態環境復雜多樣，其雜草群落組成復雜、穩定性強。茶園雜草與茶樹爭奪水分、土壤養分和生長空間，還會助長茶樹病蟲害的滋生蔓延，危害茶園，給茶樹的產量和品質帶來不利影響[2-3]。雜草防控是茶園生產管理中一項重要的工作，尤其是幼齡茶園和未封行茶園[4]。人工除草效果較好且不會對茶樹產生不利影響，但除草成本高，效率低。近年來，化學除草劑彌補了人工除草工作效率低和勞動力成本高的問題，在農業生產中的使用率呈上升趨勢[2-3,5]。長期以來，茶園主要使用的除草劑類型有草甘膦和草銨膦[6]，乙草胺作為封閉劑，20世紀90年代初我國開始引進和生產，可用于芽前防除一年生禾本科雜草和部分闊葉雜草[7-8]。不同類型的除草劑作用機理和環境穩定性不同，部分除草劑性質穩定、持效期長，雖然對雜草的防效期較長，但可能造成土壤板結、茶園生態環境破壞等問題，也可能帶來茶葉中農藥殘留的安全隱患[5]。例如作為世界農藥生產量之首的草甘膦，其安全問題近年來備受爭議。課題組前期對水培茶苗草甘膦的吸收、轉運代謝規律研究發現，作為內吸性除草劑的代表，草甘膦經茶苗根部吸收并轉運到葉部，可能是茶葉中草甘膦殘留的主要來源[9]。

由于茶樹并非除草劑的靶標植物，因此茶園除草劑的使用效果和對茶葉質量安全帶來的影響長期以來較少有人關注。我國新頒布的食品中農藥殘留限量標準（GB 2763—2016）中規定了茶葉中草甘膦和草銨膦的MRLs標準分別為1?mg·kg-1和0.5?mg·kg-1[10]，歐盟制定茶葉中兩種農藥的MRLs標準為2.0?mg·kg-1和0.1?mg·kg-1。近年來，部分出口茶葉中草甘膦除草劑超標引起了業內的普遍關注，因此篩選評價茶園常用除草劑、研究除草劑在茶園土壤中持留特性及其對茶葉質量安全的潛在影響勢在必行，不僅可以輔助人工除草、減少茶園土壤污染，也可保障茶葉質量安全。本文選用常用除草劑草甘膦、草銨膦及其復配劑型草甘膦-乙草胺和草甘膦-助劑，對茶園主要惡性雜草的防效進行了對比評價，并對試驗小區內土壤中除草劑殘留水平進行了評估。此研究將對茶園雜草的防控提供實踐指導，并為茶園除草劑的安全使用和禁限用法規制定，以及替代性農藥的選擇提供一定的理論和技術參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

商用制劑：含有效成分30%的草甘膦異丙胺鹽（中化作物保護品有限公司），含有效成分20%的草銨膦（山東省長清農藥廠有限公司），含有效成分90%的乙草胺（浙江天豐生物科學有限公司）。商用助劑：安融樂（現代科技生物助劑，北京成禾佳信農資貿易有限公司）。高效壓力溶劑萃取系統（HPSE，萊伯泰科公司）。草甘膦（98.0%）、草銨膦（97.5%）和氨甲基膦酸（99%）標準品購于德國Dr. Ehrensterfer公司。草甘膦內標（草甘膦-2-13C，15N）購于Sigma-Aldrich（上海）貿易有限公司。用純水配制成1?000?μg·mL-1的單標以及100?μg·mL-1的混標作為標準儲備溶液，于4℃冰箱保存。純水稀釋標準儲備液配制成不同濃度的標準工作溶液；有證標準物質乙草胺（丙酮配制濃度為100?μg·mL-1）購自北京壇墨質檢科技有限公司，丙酮稀釋標準儲備液成不同濃度水平的標準工作液；衍生化試劑為氯甲酸-9-芴基甲酯（FMOC-Cl）購自阿法埃莎（中國）化學有限公司，并用丙酮配制成20?g·L-1的衍生化溶液，標準工作液及衍生化溶液均需現配現用。硼酸鹽緩沖溶液（pH=9）：稱取5?g硼酸鈉（Na2B4O7·10H2O），用水溶解并定容至100?mL，用5?mol·L-1HCl調pH至9。

1.2 靶標植物

根據課題組前期對茶園雜草的調查研究結果，選擇本試驗階段內主要發生4種惡性靶標雜草作為統計對象，包括：花葉滇苦菜[續斷菊，(L.) Hill.]、刺兒菜[小薊，(Willd.) MB.]、野老鸛草（老鸛嘴，L.）和小飛蓬[(L.) Cronq.]。

1.3 試驗設計

1.3.1 田間試驗

選取安徽農業大學高新技術農業園內的茶園為試驗小區，設5個處理組（4次重復），每小區面積約為6?m2，隨機排列（圖1），各處理小區中間設置隔離行。草甘膦、草銨膦處理組噴施劑量為制劑標簽上推薦劑量，草甘膦-乙草胺處理組為推薦劑量的50%，草甘膦-助劑處理組為推薦劑量（具體劑量見表1）。二次稀釋法配藥，先配成母液再進一步稀釋，每公頃兌水量為450~750?kg，采用手持式噴霧器（2.5?L）定量噴霧法均勻進行莖葉噴霧，以清水作為對照。

注：各小區分布，a：草甘膦；b：草銨膦；c：草甘膦+乙草胺；d：草甘膦+助劑；e：對照

1.3.2 防治效果

噴施農藥后，每周觀察1次，對試驗小區內雜草的覆蓋度進行評價[11]，并對4種惡性雜草計數，測定其株防效，綜合評價除草劑防治效果。考慮到田間試驗平行小區間植物生長狀態和多樣性等存在一定差異，此次試驗的株防效是采用所有平行小區內該雜草的總株數進行計算，公式如下：

株防效/%=（處理前平行小區內雜草總株數－處理后平行小區內雜草總株數）/處理前平行小區內雜草總株數×100。

1.3.3 取樣

分別于0（噴施農藥2?h后待雜草葉面全干記為0?d的樣品）、1、3、7、14、21、30、58?d隨機抽取各小區土壤樣品，取土深度0~15?cm，采樣量不少于1?kg，自然風干土壤，混勻后過40目（孔徑425?μm）篩，裝入封口袋中保存在–20℃冰箱中待測。田間噴施農藥后第5天采摘草甘膦處理小區內的茶樹新梢測定殘留量[9]。

表1 試驗小區內藥劑噴施劑量

1.4 樣品前處理

1.4.1 草甘膦、草銨膦、氨甲基膦酸土壤樣品處理

稱取干燥土壤樣品0.5?g于50?mL離心管中，添加內標1?mg·kg-1，加入10?mL 0.6?mol·L-1的KOH，振蕩30?min，4?000?r·min-1離心30?min并過濾得上清液，用6?mol·L-1HCl和0.6?mol·L-1HCl調節上清液pH至7，取1?mL提取液，加入1?mL硼酸鹽緩沖液（pH=9）充分混勻，再加入1?mL衍生化試劑進行衍生化反應（不少于12?h）后，10?000?r·min-1離心10?min，反應液過PTFE濾膜后進行LC-MS/MS分析。

1.4.2 乙草胺土壤樣品前處理

取土壤樣品10?g，與6?g硅藻土混合均勻，裝填至22?mL的萃取罐中。用同樣方法裝填好2個萃取罐，置于HPSE中（雙通道運行，可同時萃取2個樣品），萃取溶劑為丙酮∶正己烷（1∶1），系統壓力10.34?MPa，萃取溫度100℃，加熱平衡時間2?min，靜態萃取時間6?min，沖洗體積60%，氮氣吹掃60?s，循環運行兩次。萃取液收集到60?mL收集管中。轉移收集液到250?mL旋蒸瓶中，用正己烷-丙酮混合溶劑洗滌收集管3次，每次5?mL，合并所有提取液40℃旋轉蒸發至近干，用5?mL正己烷洗滌旋蒸瓶，得到復溶液。將弗羅里硅土固相萃取柱依次用5?mL正己烷-二氯甲烷（正己烷∶二氯甲烷=1∶9）混合溶劑和5?mL正己烷活化，當溶劑液面到達固相萃取柱吸附填料上表面時，立即導入復溶液，用100?mL旋蒸瓶收集淋洗液，并用5?mL正己烷-二氯甲烷混合溶劑洗滌原旋蒸瓶過柱，每次5?mL，淋洗3次，收集淋洗液，40℃旋轉蒸發至近干，用5?mL正己烷溶解，50℃氮吹至近干，用1?mL正己烷準確定容，按照本文1.5.2章節進行氣相色譜（GC）分析。

1.4.3 茶樹新梢樣品前處理

稱取茶新梢0.25?g于50?mL離心管中，倒入研缽中，添加10?mL純水進行研磨，超聲30?min后5?000?r·min-1離心5?min。取上清液于50?mL離心管中，加入2.5?mL二氯甲烷，渦旋2?min后5?000?r·min-1離心5?min。移取2?mL上清液于5?mL離心管中，加入5?mg GCB和50?mg PVPP，渦旋2?min，以10?000?r·min-1離心10?min。移取1?mL上清液，加入1?mL硼酸鹽緩沖液，渦旋2?min，再加入1?mL FMOC-Cl混勻，室溫下衍生化反應，放置過夜。將衍生化后的溶液以10?000?r·min-1離心10?min，過0.22?μm親水性濾膜，待LC-MS/MS檢測。

1.5 儀器分析

1.5.1 LC-MS/MS分析

安捷倫液相色譜串聯三重四極桿質譜儀（LC-MS/MS）：1260超高效液相色譜儀串聯6460三重四極桿質譜（美國安捷倫科技有限公司），色譜柱：Agilent EC-C18（1.8?μm×2.1?mm ×50?mm），柱溫：30℃，進樣量5?μL，流動相流速為0.3?mL·min-1，A相為0.002?mol·L-1甲酸銨，B相為乙腈。梯度洗脫程序為：0~1.5?min：10%~50% B，1.5~2?min：50%~95% B；2~3?min：95%~95% B；3~3.1?min：95%~10% B；3.1~6?min：10% B。質譜：電噴霧離子源，正離子掃描模式，鞘氣溫度為350℃，鞘氣流速為11.0?L·min-1，霧化氣壓力為35.0?psi，檢測方式為多反應監測，質譜參數見表2。

1.5.2 GC分析

氣相色譜7890B（美國安捷倫科技有限公司），色譜柱：HP-5毛細管柱30?m×0.32?mm×0.25?μm，進樣口溫度：250℃，尾吹氣流量：15?mL·min-1，進樣方式：不分流，載氣：氮氣，流速：1.0?mL·min-1，程序升溫：初溫為100℃，25℃·min-1升至230℃，保持1?min，再以5℃·min-1升至260℃，保持1?min，后以10℃·min-1升至270℃，保持3?min，檢測器溫度：300℃。

表2 草甘膦、草銨膦和氨甲基膦酸質譜參數

2 結果與分析

2.1 方法驗證

2.1.1 LC-MS/MS分析

分別稱取0.5?g空白土壤于離心管中，添加0.1?mg·kg-1和1?mg·kg-1草甘膦、草銨膦和氨甲基膦酸混合標準溶液（6次重復），參照1.4和1.5章節中的方法分析，使用內標法定量，0.05?μg·mL-1草甘膦標準溶液和0.05?μg·mL-1草甘膦內標計算校正因子為0.848。方法學評價結果見表3，3種農藥標準溶液在0.001~0.5?μg·mL-1呈現良好線性關系，相關系數2超過0.99，回收率為66.4%~90.1%，相對標準偏差（RSD，n=6）為4.00%~19.10%，方法的定量限為0.1?mg·kg-1。

2.1.2 GC分析

乙草胺的加標含量為0.005?mg·kg-1和0.100?mg·kg-1（重復5次），測定加標回收率、重復性和檢測限。方法學評價結果見表3，乙草胺標準溶液在0.01~1.0?μg·mL-1呈現良好的線性關系，相關系數R超過0.99，回收率均在102.7%~110.2%之間，RSD（n=5）在0.13%~4.20%，方法的定量限為0.005?mg·kg-1。

2.2 不同除草劑對茶園雜草防效比較

2.2.1 藥害觀察

各藥劑處理區茶樹生長正常，未見藥害產生。

2.2.2 田間藥效

4個施藥小區噴施草甘膦、草甘膦+乙草胺、草甘膦+安融樂、草胺磷后，分別于7、14、21?d對野老鸛、續斷菊、小飛蓬和小薊雜草計數，結果見表4，7?d后，各處理組雜草防效均低于70%；第14天，草甘膦對小飛蓬的防效達96.88%，對小薊的防效達100%；第21天，草甘膦對野老鸛、續斷菊、小飛蓬和小薊雜草的防效超過90%；草甘膦+乙草胺組14?d后對小飛蓬的防效達92.50%（小薊為100%），第21天對續斷菊和小薊雜草防效在95%以上；草甘膦+助劑組第14天對小飛蓬的防效達100%，第21天對續斷菊的防效達96.40%；草銨膦組第14天對野老鸛、續斷菊和小飛蓬雜草的防效達95%以上，第21天對這3種雜草的防效均達100%。

各藥劑對茶園雜草蓋度的影響結果見圖2。第7天各處理組的雜草蓋度均明顯低于處理前，從第7天到第56天，雜草蓋度先降低后增加，第21天時，雜草蓋度最低，草甘膦、草甘膦+乙草胺混劑、草甘膦+助劑混劑和草銨膦各處理組分別為4.6%，4.3%，5.9%，6.3%。草甘膦+乙草胺處理組第35天和第56天，雜草蓋度均低于其他3個處理組，顯示乙草胺處理組作為封閉型除草劑，對一年生禾本科及部分闊葉雜草起到較好的防治效果。第56天，4個處理組雜草蓋度均高于處理前，說明雜草生長到處理前的狀態或者比處理前更加茂盛，結合表4的防治效果，進一步證明4組藥劑在處理后的第21天達到最好雜草防治效果，隨后受害雜草恢復或者新生雜草萌發；4組藥劑中草銨膦對雜草的防治起效快，商品化助劑無顯著增效作用。

表3 草甘膦、草銨膦、氨甲基膦酸和乙草胺在土壤中的添加回收率和相對標準偏差

表4 不同藥劑對茶園雜草的防效

注：BT：藥劑處理前，PMG：草甘膦；PMG+ACE：草甘膦+乙草胺；GLU：草銨膦；PMG+ARL：草甘膦+助劑

2.2.3 農藥殘留動態

進一步比較了0~58?d后土壤中各除草劑的殘留降解動態（圖3），結果表明，含草甘膦除草劑的3個試驗小區（草甘膦、草甘膦+乙草胺和草甘膦+助劑）在施藥2?h后，草甘膦殘留分別為1.20、0.57、1.45?mg·kg-1，草甘膦的降解產物氨甲基膦酸殘留分別為0.62、0.41?mg·kg-1和1.38?mg·kg-1（草甘膦制劑中并未檢測到降解產物氨甲基膦酸），結果表明草甘膦在土壤中降解較快，可能是茶園土壤中微生物和茶園土壤特性促進了草甘膦降解[12-14]。3個試驗小區土壤中草甘膦殘留濃度隨著時間的延長總體呈現降低、增加、降低的波動趨勢，可能是草甘膦被土壤中的有機質和礦物質等土壤組分不斷吸附解析，或因微生物及光照等作用發生降解[15]。施藥后第58天，3個小區土壤中草甘膦消解率分別為95%、53%和66%（圖3-a、圖3-c1、圖3-d）。草銨膦、乙草胺在土壤中的殘留動態與草甘膦顯著不同，草銨膦處理后58?d的土壤中草銨膦的消解率為97%，第7天的土壤殘留濃度突然降低可能是取樣不均勻所致（圖3-b）；乙草胺殘留逐漸降低，58?d后消解率為99%（圖3-c2）。課題組前期對水培茶苗草甘膦的吸收、轉運代謝規律研究發現，草甘膦可經茶苗根部吸收并轉運到葉部，第5天葉部的累積量達到最高值，隨后逐漸降低。此次，我們在藥劑噴施后的第5天，采摘草甘膦處理小區和對照小區內的茶樹新梢，檢測草甘膦的殘留量，發現處理組與對照組茶樹新梢中草甘膦的殘留量均低于定量限，說明本試驗過程中草甘膦的噴施未造成茶葉中草甘膦殘留，因此草甘膦單次施藥對茶鮮葉中草甘膦殘留影響不大。

3 討論

試驗結果表明，與草甘膦相比，草銨膦農藥起效快，施藥第7天覆蓋度為9.15%，施藥14?d對野老鸛、續斷菊、小飛蓬等雜草的防治效果在95%以上，而且草銨膦在土壤中的殘留降解較快，30?d的消解率達到94%，殘留水平較低（第58天殘留量為0.01?mg·kg-1），因此，草銨膦或許可以作為草甘膦替代性除草劑用于茶園雜草防治。另外，乙草胺對禾本科雜草的出苗率有一定的抑制作用，且乙草胺在土壤中降解相對較快（21?d后的消解率為97%），因此乙草胺可作為禾本科雜草和其他雜草的苗前處理劑。然而，有關這類除草劑的田間藥效評價需進一步利用比較生物量的統計方法加以驗證，且除草劑對茶園土壤生態環境及茶葉質量安全造成的潛在影響有待于進一步評估。

注：a：草甘膦；b：草銨膦；c1和c2：草甘膦+乙草胺；d：草甘膦+助劑，PMG：草甘膦；AMPA：氨甲基膦酸；GLU：草銨膦；ACE：乙草胺

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Weeds Control Effect and Residues of Several Herbicides in Tea Gardens

GAO Wanjun1, ZHANG Yongzhi1, TONG Mengmeng1, MA Huiqin2, QIAN Shanshan3,WANG Tianyu3, LI Yeyun1, WU Huiping2*, HOU Ruyan1*

1. State Key Laboratory of Tea Plant Biology and Utilization, Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China;2. School of Plant Protection, Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China;3. Public Inspection Institute(Anhui) Co., Ltd, Hefei 230051, China

The weeds control effect of several herbicides (glyphosate, glufosinate and combination of glyphosate-acetochlor and glyphosate-auxiliaries) and the herbicides residues in the soil of treated plots in the tea gardens were compared. The results show that the glufosinate had a faster control effect on the weeds. The coverage of weeds decreased to 9.15% on the 7thtreatment day. The control efficiency of glufosinate to theL.,(L.) Hill.,(L.) Cronqreached more than 95% on the 14thday. Glufosinate showed a faster degradation (the dissipation ratio was 94% on the 30thday) in the soil than the glyphosate (the residue concentration was 0.01?mg·kg-1on the 58thtreatment day). Therefore, glufosinate might be an alternative herbicide for weed control in tea gardens. Acetochlor, as a closed herbicide, had the potential of inhibiting the emergence of gramineous weeds and faster dissipation rate in the soil (the dissipation ratio was 97% on the 21thday), and therefore, it was recommended to control gramineous or the other weeds.

tea garden, herbicide, efficacy, pesticide residue

S571.1；S482

A

1000-369X(2019)05-587-08

2018-12-20

2019-02-19

國家重點研發計劃項目（2016YFD0200900）、國家自然科學基金（31772076和31270728）

高萬君，女，碩士，主要從事茶葉化學與安全方面的研究。*通信作者：whp@ahau.edu.cn；hry@ahau.edu.cn