醫用交聯透明質酸鈉凝膠微球的制備及性能

周 奎，鄧連霞，杜瑤瑤，黃 偉

（杭州協合醫療用品有限公司，浙江 杭州 310018）

0 引言

透明質酸（hyaluronicacid，HA），又稱玻尿酸，是由N-乙酰氨基葡萄糖和葡萄糖醛酸通過糖苷鍵交替連接而成的大分子酸性粘多糖。透明質酸多分布于哺乳動物的結締組織和體液中，是構成皮膚細胞間質的成分，其通常以透明質酸鈉鹽的形式存在[1-3]。透明質酸主要是由動物組織提取和微生物發酵兩種途徑制備得到[4-5]。HA分子中含有較多羥基和羧基，賦予了其很好的保濕性和清除自由基的功能，被廣泛用于化妝品中。但由于透明質酸在組織間易被擴散和降解，體內存留時間短，難以充分發揮其物理化學特性，在實際應用中具有一定的局限性。為了彌補這些缺陷，需要對透明質酸進行化學修飾或交聯，從而得到性能更優異的透明質酸衍生物。透明質酸衍生物被應用于微整形、組織填充、藥物緩釋、控釋載體等領域[6-10]。

為獲得充分、均勻的反應體系，以二乙烯基砜為交聯劑，采用乳化法制備醫用交聯透明質酸鈉凝膠微球，考察了乳化轉速、乳化時間、油水比、乳化劑濃度、透明質酸鈉起始濃度等因素對凝膠微球粒徑的影響。在相對優異的條件下，制備出粒徑均勻的交聯透明質酸鈉凝膠微球，對其相關性能進行檢測，檢測結果符合《整形手術用交聯透明質酸鈉凝膠》（YY/T 0962-2014）要求。為工業化制備交聯透明質酸鈉凝膠微球提供一些數據參考。

1 實驗

1.1 試劑及儀器

透明質酸鈉 （華熙福瑞達生物醫藥有限公司）；二乙烯基砜（Sigma-Aldrich Co.LLC）；氫氧化鈉（國藥集團化學試劑有限公司）；span80（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；液體石蠟（江蘇強盛功能化學股份有限公司）；環己烷、無水乙醇（永華化學科技（江蘇）有限公司）；AE500S-P實驗室剪切乳化機；CV0100馬爾文流變儀；HG1697推拉力機；數顯顆粒圖像分析儀。

1.2 實驗方法[11-17]

（1）水相：稱取一定量透明質酸鈉干粉于燒杯中，分多次加入1%氫氧化鈉溶液，攪拌1 h，至透明質酸鈉溶解完全，透明，肉眼觀察無不溶解顆粒物。

（2）油相：稱取一定量的液體石蠟和span80，兩者按照一定比例稱取，攪拌均勻。

（3）將溶解后的透明質酸鈉堿性凝膠轉移到油相燒杯中。設置好乳化轉速和時間，使用乳化機對油水混合相進行乳化。

（4）乳化結束，向乳液中加入一定量的交聯劑二乙烯基砜，室溫攪拌2 h，于50℃下反應2～4 h。交聯反應結束，待乳液冷卻，先后使用乙酸乙酯和無水乙醇對乳液進行清洗處理，靜置分層，倒去上清液，除去殘留液體石蠟及span80。將得到的凝膠顆粒溶于磷酸鹽緩沖液中，溶脹過夜。倒去上清液，收集下層交聯透明質酸鈉凝膠微球，采用顯微計數法[14]統計微球的粒徑，每次計數不少于300粒。將凝膠微球灌裝于1.0 mL注射器中，進行高壓蒸汽濕熱滅菌（121℃，15 min）。

1.3 性能檢測

1.3.1 粘彈性

取適量凝膠樣品，采用馬爾文流變儀進行測定。在25℃下，在0.05～10 Hz范圍內，繪制彈性模量G和粘性模量G〃的對數與頻率的對數坐標圖，在1.0 Hz頻率下的粘性模量和彈性模量。

1.3.2 推擠力

將27G注射針安裝到注射器上，模擬實際使用情況。以20 mm/min恒定速度推動推進桿，注射器中的樣品經由針頭被推擠出，得到推擠力曲線。由推擠力曲線可以看出樣品擠出過程中推擠力大小及樣品分散均勻情況。

1.3.3 溶脹度

稱取適量凝膠樣品，在105℃溫度下烘干至恒重，稱量恒重質量m1。滴加純化水至溶脹完全后，用吸水紙吸取多余的水分，稱量溶脹后的質量m2。溶脹度計算公式為

2 結果與討論

2.1 HA起始濃度對粒徑的影響

HA起始濃度是影響透明質酸鈉乳化反應效果的因素之一，不僅對交聯效果起重要作用，而且對凝膠微球的粒徑起關鍵作用。當HA濃度低于1%時，透明質酸鈉在乳液體系中很難形成有規則的凝膠。本節選用1%、3%、5%、8%、10%五個不同濃度，在固定其他參數的條件下進行實驗，比較不同HA起始濃度下制得的凝膠微球粒徑，如圖1。由圖1看出，當HA起始濃度為8%時，所制備的凝膠顆粒平均粒徑為38.0μm。

Chart 1 The effect of HA initiation concentration on gel-particle size

2.2 乳化時間對粒徑的影響

在乳化過程中，分散相在高速乳化實驗機外力的作用下，經過一定時間才能形成均一粒徑、穩定的乳液。為了得到預期粒徑的交聯透明質酸鈉凝膠顆粒微球，需要對乳化時間進行控制，在固定其他參數的條件下，以5 min為間隔，選取5～25 min間的5個時間點進行實驗，乳化時間對粒徑的影響如圖2所示。從圖2可以看出，在固定其他實驗參數的條件下，不同乳化時間對凝膠粒徑的影響較大。當乳化時間為20 min時，所得凝膠平均粒徑較小，粒徑為26.2μm。乳化時間過短，凝膠還未形成有效分散；乳化時間過長，會導致乳液不穩定，進而導致乳液微滴的粘連。

2.3 油水比對粒徑的影響

Chart 2 The effect of emulsion time on gel-particle size

本節實驗選取不同的油水比，在固定其他因素條件下，進行一系列實驗，結果見圖3。凝膠微球的平均粒徑隨著油水比的增加而變小，兩者間呈現一定的關聯性，油水比越小，油相分散能力越強，所制備凝膠的平均粒徑越小。當油水比為1/4時，凝膠微球平均粒徑為40.0μm。

Chart 3 The effect of oil/water ratio on gel-particle size

2.4 乳化劑濃度對粒徑的影響

乳化劑可以有效降低兩相界面的張力，促進相互分散，有利于凝膠顆粒的形成。本實驗選用span80作為乳化劑，在實驗過程中，固定其他條件，針對乳化劑對凝膠粒徑的影響進行研究。由圖4可以看出，在一定初始范圍內，凝膠微球的平均粒徑隨著乳化劑濃度的增加而快速變小，當乳化劑達到一定濃度后，凝膠微球平均粒徑基本不變。當乳化劑濃度為1.5%時，凝膠微球平均粒徑為48μm。

Chart 4 The effect of emulsifier concentration on gel-particle size

2.5 乳化轉速對粒徑的影響

在乳化實驗過程中，選用5個不同乳化轉速，固定其他反應參數，得出如圖5結果。在特定乳化轉速范圍內，凝膠微球的平均粒徑隨著乳化轉速的提高而變小。當乳化轉速較低時，不能有效分散成乳液；增加轉速，剪切力增大，乳液不易沉降，從而形成均勻粒徑的凝膠微球。當乳化轉速為2500 r/min時，凝膠微球平均粒徑達到56 μm。

Chart 5 The effect of stirring speed on gel-particle size

2.6 性能檢測[18-21]

在各因素設定為較佳實驗參數下（透明質酸鈉起始濃度為8%、油水比為1/4、乳化劑濃度為5%、乳化轉速為2500 r/min、乳化時間為20 min）制備交聯透明質酸鈉凝膠微球，對其主要性能進行檢測，結果見表1、圖6～圖8。

Diagram 1 performance test

Chart 6 gel-particle size distributions

Chart 7 push force of the gel

Chart 8 Viscoelasticity of the gel

3 結論

通過乳化法制備醫用交聯透明質酸鈉凝膠微球，對HA起始濃度、乳化轉速、乳化時間、乳化劑濃度及油水相比等參數進行初步研究，并對參數進行適當調整和優化，在較為理想的乳化條件下制備出符合性能要求的醫用交聯透明質酸鈉凝膠微球。所制備的醫用交聯透明質酸鈉凝膠微球樣品性能穩定，粘彈性較低、推擠力較小且平穩。在面部整形手術中，可以得到很好的效果。本方法工藝簡單，實驗過程易于控制，反應條件溫和，解決了交聯反應不均勻的問題。該方法可以進行快速放大生產，便于工業化生產，所制備的醫用交聯透明質酸鈉凝膠微球具有良好的應用價值。