脂肪間充質干細胞在糖尿病足治療中的研究進展

張筱薇　徐剛

[摘要]隨著糖尿病患病率的增加，糖尿病足作為糖尿病常見并發癥，其患者數量明顯增多，傳統的治療方法使用后并不能達到良好的治療效果，使糖尿病足的截肢率居高不下。脂肪間充質干細胞（Adipose Derived Stem Cells，ADSCs）具有自我更新能力及多向分化潛能，由于脂肪組織來源廣、大量獲取簡便，被認為是骨髓間充質干細胞（Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells，BMSCs）良好的替代品。當前ADSCs移植是一種安全、有效的新方法，實驗研究表明其通過減輕炎癥反應，促進血管新生，促進肉芽組織形成及加速上皮化形成等作用而促進糖尿病足潰瘍創面愈合，為糖尿病足的治療指引了新方向。本文綜述了ADSCs在糖尿病足治療中的作用機制、實驗研究及最新臨床研究進展，在探索糖尿病足治療新方法的道路上具有重要意義。

[關鍵詞]糖尿病足;慢性創面;脂肪間充質干細胞;血管化;上皮化

[中圖分類號]R587.1? ? [文獻標志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2019）10-0165-05

Abstract： With the increasing of the prevalence of diabetes ， diabetic foot is a common complication of diabetes ， and the number of diabetic foot patients is obviously increased . The traditional treatment method cannot achieve good therapeutic effect and the amputation rate of diabetic foot is still high. ADSCs have self-renewal ability and multi-directional differentiation potential. They are considered as good substitutes for bone marrow mesenchymal stem cells due to their wide source of adipose tissue and easy access. At present， ADSCs transplantation is a safe and effective new method. Experimental studies have shown that it can promote the healing of diabetic foot ulcers by reducing inflammation， promoting angiogenesis， promoting granulation tissue formation and accelerating epithelialization. It has provides new directions for the treatment of diabetic foot. This article reviews the mechanism， experimental research and the latest clinical research progress of ADSCs in the treatment of diabetic foot， which is of great significance for us to explore new ways to treat diabetic foot.

Key words： diabetic foot;chronic wound;adipose derived stem cell;vascularization;epithelialization

當前糖尿病（diabetes mellitus，DM）患者全球范圍內的數量呈逐漸增多趨勢，預計2035年DM患者將高達5.92億[1]，隨著社會人口老齡化，我國的DM患者人數已接近1億[2]。足部是糖尿病病變的主要發生部位，在糖尿病微環境下，血管內皮細胞功能障礙，細胞增殖能力減低、生長因子抵抗導致上皮形成能力下降，導致創面難愈[3];內皮細胞遷移及膠原蛋白合成障礙[4]，導致糖尿病足潰瘍長期不愈;由于神經感覺缺失，可能進一步加重創傷性組織損失。當前DF前期的傳統治療方法中主要采用皮瓣移植、負壓輔助封閉治療、高壓氧療法、電磁療法及生長因子療法[5]，但這些方法并不能從根本上解決問題，后期效果并不理想，最終患者仍逃不開截肢的厄運。研究表明，脂肪間充質干細胞（Adipose Derived Stem Cells，ADSCs）具有自我更新能力與多向分化潛能[6]，ADSCs的注射可以促進血管新生及血管網的形成[7-8]，使下肢血供得到恢復，從而改善下肢缺血癥狀。因此，干細胞治療糖尿病足已成為全世界學者研究的新方向。本文就ADSCs移植治療糖尿病足的研究進展綜述如下。

1? 糖尿病足

足部是糖尿病病變的主要發生部位，由于下肢遠端神經異常，血管病變引起足部感染或潰瘍，導致深層組織破壞，伴隨病情加重其主要癥狀也隨之改變，其中包含：輕度神經癥狀、缺血性靜息痛、糖尿病足潰瘍、Charcot關節病及神經病變性骨折同時伴隨感染、免疫缺陷和下肢血管病變等[9]。當前，糖尿病患者中足部潰瘍的發生率為4%～10%，其中在所有糖尿病引發的低位遠端截肢中，85%由足部潰瘍引發[10]。我國研究發現因糖尿病足住院的患者中截肢率為11.4%，小截肢以及重大截肢的發生率分別為5.4%和6.0%，兩次截肢的患者高達17.9%[11]。糖尿病足（Diabetic Foot， DF）為進行性病變，但由于患者就診及日常保健意識較差，往往待疾病進展至糖尿病潰瘍期甚至伴隨骨髓炎期才至醫院就診，常伴隨感染及下肢血管病變，使治療難度增大。

2? ADSCs治療糖尿病足的作用機制

2.1 改善糖尿病足患肢血供及局部血運障礙：周圍血管病變（peripheral artery disease，PAD）是糖尿病足發病的危險因素之一，在臨床上有著重要意義。Zografou在研究中發現，糖尿病小鼠中ADSCs能夠分化成為內皮細胞，并且促進機體釋放生長因子如血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和VonWillibrand 因子，一方面內皮細胞增生，另一方面減少了內皮細胞凋亡，對于局部微循環重建起到了重要作用[12]。Madonna等[13]在糖尿病下肢缺血大鼠模型中移植ADSCs，發現橫紋肌肌動蛋白、VEGF和肝細胞生長因子（HGF）明顯增多，磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）血管造影結果表示血管密度明顯增加，下肢血供得到顯著改善。在高糖環境下，ADSCs可以正向調節機體釋放生長因子，促進血管生成，改善糖尿病足下肢血運，從而使癥狀得以緩解。

2.2 促進糖尿病足潰瘍創面愈合：糖尿病性傷口愈合不良通常受其并發癥的影響，如：創傷、外周血管疾病、創面感染以及神經病變。目前的研究資料表示，ADSCs促進糖尿病足潰瘍創面愈合主要通過以下五個方面：

2.2.1 ADSCs減輕創面炎性反應：炎性反應是正常的機體防御反應，當其受到外界刺激時，機體將創傷部位的壞死組織及時清除，限制組織損傷進一步發展，并且加速了組織的修復。Wang X[14]研究發現，間充質干細胞來源外泌體（MSCs-Exo）中含有豐富的miRNA，保護受損組織，降低炎癥毒性傷害并提升組織耐受性，在調控炎癥過程中起著至關重要的作用。隨后何強[5]的研究也證實了這一點。董瑤等[15]在小鼠創面四周注射ADSCs后，發現創面組織中的促炎因子表達下降，如：IL-6、白細胞介素-1（IL-1）及單核細胞趨化蛋白-1（TCP-1）等，而白細胞介素-10（IL-10）等抗炎因子表達上升，因此，推測ADSCs可以使創面局部的炎癥反應降低，從而加速皮膚創面的愈合。糖尿病足創面形成一種低氧環境，ADSCs對缺氧耐受，并且能夠在缺氧的環境中釋放抗氧化物質、自由基清除劑、熱休克蛋白等，清除損傷組織所處微環境中的毒素，從而達到促進殘存細胞恢復的效果[16]。

2.2.2 ADSCs促進創面的血管新生以及血管網的形成：創面內新生的毛細血管網，為創面提供了生長所必需的氧氣、營養物質以及生物活性蛋白，縮短創面愈合時間，提高創面治愈率，內皮細胞和平滑肌細胞的相互作用對于形成成熟且有功能的血管網具有重要意義。ADSCs-Exo通過轉運多種miRNA（miRNA-31、miRNA-125a）與蛋白質進入內皮細胞，促進內皮細胞參與血管生成[5]。當前研究已證實，無論在體內還是在體外，ADSCs均可分化為血管內皮細胞、平滑肌細胞;同時分泌多種細胞因子與機體內促進血管新生的細胞共同作用，促進血管生成，達到共同完成受損組織修復的目的。Nie等[7，17]研究表明ADSCs可以促進VEGF、HGF和FGF2等血管生長因子分泌，從而促進血管新生。

2.2.3 ADSCs促進肉芽組織生成：在創面修復過程中，成纖維細胞能夠遷移至創面，并通過有絲分裂大量且迅速增殖，加快毛細血管的生成，形成新生毛細血管網，創面血供得以恢復;也可合成和分泌大量基質成分和膠原纖維，加快肉芽組織形成，修補組織缺損。Kim[18]研究發現用ADSCs處理創面后，細胞外基質明顯沉積，組織厚度顯著增加。Navone[19]研究證實ADSCs明顯提高I型膠原的分泌與重塑。Stessuk T[20]研究發現，ADSCs在傷口愈合過程中大量分泌生長因子和細胞因子，進一步促進成纖維細胞與角化細胞體外增殖，從而加速肉芽組織形成。何勇等[21]研究也證實了這一點。Jung等[22]發現TGF-β1是ADSCs中一個不可或缺的旁分泌介質，它決定了透明質酸和膠原的合成。機體在高糖環境下基質與膠原形成受到影響，而ADSCs能夠正向促進基質沉積及膠原纖維形成，從而加快肉芽組織的生成。

2.2.4 ADSCs促進創面收縮：肌成纖維細胞是肉芽組織中的主要細胞成分，它由創面周邊成纖維細胞在各種刺激因子的作用下形成;由于它本身具有成纖維細胞的全部生理功能，并且還帶有平滑肌細胞的某些特點，所以它在創面收縮中起著重要的作用。Lee等[23]研究表明，ADSCs能夠誘導成纖維細胞表型向肌成纖維細胞轉變，也可促進成纖維細胞-膠原蛋白晶格復合物收縮。Shen[17]研究發現，ADSCs促進TGF-β1生成，而TGF-β1有促進細胞遷移、增加基質沉積及加快創面收縮的作用。Nambu[24]通過研究ADSCs聯合膠原治療糖尿病小鼠創面時，血中細胞生長因子如成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor，FGF）、血小板衍生生長因子（PDGF-bb）、HGF、白細胞介素-6（IL-6）以及VEGF相較于單純膠原組明顯升高，提高傷口愈合率。以上研究結果表明ADSCs通過促進肌成纖維細胞形成，增加細胞生長因子分泌，從而達到促進糖尿病足創面收縮的效果。

2.2.5 ADSCs促進創面的再上皮化：在創面愈合的一系列過程中，表皮角質細胞通過遷移、增殖、分化后形成了新的表皮層，這是創面愈合的必經之路，也是創面恢復的重要標志。邱堯[25]利用ADSCs的上皮分化潛能，通過局部注射ADSCs，促進其分化為角質細胞，從而加速傷口上皮化。趙京禹[26]發現ADSCs有促進創面中的表皮細胞由周圍向中央遷移的能力;其后通過對移植ADSCs后的組織免疫熒光染色檢測，結果顯示ADSCs在體內可表達CK19，近一步證明了ADSCs在體內可分化成表皮細胞，促進創面的再上皮化。有研究表明[12]，經過ADSCs治療后的創面，轉化生長因子-β3（transforming growth factor-β3，TGF-β3）水平增高，而TGF-β3作為體內抗瘢痕因子，增強膠原蛋白產生，并調節傷口再上皮化。

2.3 改善糖尿病周圍神經病變：ADSCs現已廣泛治療多種疾病[27]，其機制包括免疫調節功能、作用于目標細胞、釋放相關神經營養因子（表皮生長因子、bFGF、TGF-β、VEGF、HGF、IGF-1），而在糖尿病周圍神經病變中缺乏以上大部分因子。一項臨床研究表明，自體移植ADSCs可有效作用于糖尿病下肢缺血患者的周圍神經病變，使其得到改善[28]，但是也有研究結果顯示糖尿病慢性缺血性并發癥的患者，體內自體脂肪干細胞較正常人分化能力和活力降低，并非理想的干細胞來源[29-30]，在這方面仍有爭議，需要進一步的動物實驗和臨床研究證實。

3? 脂肪間充質干細胞治療糖尿病足的實驗研究及臨床應用

3.1 ADSCs直接注射：動物實驗方面，南華等[31]將標記的ADSCs通過尾靜脈移植到創傷小鼠體內。結果顯示，創面愈合組織中所見的熒光分布明顯遠多于正常皮膚組織，整齊且規律。于是他們又對比局部注射和尾靜脈注射的方法，結果表明局部途徑創面愈合較快。組織學觀察顯示通過局部途徑移植ADSCs后，創面中不成熟的腺樣結構相對較多，而通過全身途徑移植ADSCs后，創面內新生血管形成更多[32]。臨床研究方面，Lee及其同事觀察到[28]，糖尿病患者的自體ADSCs增殖能力較正常人低，但通過多點肌內注射移植自體ADSCs，隨訪6個月后，約有65%的糖尿病下肢缺血的患者得到臨床緩解，血管造影也提示側支循環明顯增多。Qin H等[33]將人臍帶間充質干細胞（Human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells， HUCMSCs）注射于糖尿病足潰瘍周圍，于3個月的隨訪期內發現，相對于對照組，試驗組患者皮溫、踝肱比、經皮氧分壓和跛行距離均有明顯改善，這對ADSCs用于DFU的臨床治療有積極參考作用。

3.2 脂肪間充質干細胞水凝膠（Adipose-Derived Stem Cells-Hydrogel，ADSCs-Hydrogel）：動物實驗方面，Wang等[34]用抗菌多肽FHE水凝膠（F127/OHA-EPL）聯合ADSCs，刺激脂肪間充質干細胞外泌體（Adipose derived stem cell exosomes， ADSCs-Exo）釋放從而達到提高糖尿病足潰瘍創面愈合能力。Chen S等[35]將BMSCs聯合水凝膠用于糖尿病足小鼠創面模型上發現傷口較對照組明顯縮小。林凱桑等[36]用Pluronic F127水凝膠負載脂肪干細胞用于糖尿病大鼠潰瘍創面研究發現創面愈合時間及愈合率明顯高于對照組及單純ADSCs組。在臨床研究方面，Moon等[37]將ADSCs-Hydrogel用于治療糖尿病足潰瘍，其效果明顯優于聚氨酯膜治療的對照組。當前如何將ADSCs移植至創面發揮作用是干細胞移植治療糖尿病足的一個關鍵挑戰，目前關于ADSCs-Hydrogel的研究多局限于動物實驗，廣泛用于臨床研究還需更長時間。

3.3 脂肪間充質干細胞膜片（Adipose-Derived Stem Cells-Sheet，ADSCs-Sheet）：ADSCs-Sheet是當前一種新型的治療手段，目前已經有其相關皮膚創面與組織修復的實驗研究，其主要優勢在于可以分泌多種細胞生長因子，抑制炎癥反應，促進血管再生及上皮再生重塑[38-39]。動物實驗方面，陳梅紅等[40]利用ADSCs作為種子細胞構建細胞膜片，移植于裸鼠潰瘍創面上結果發現，創面愈合速度明顯快于對照組。Kato等[41]將ADSCs-Sheet用于糖尿病大鼠皮膚潰瘍模型上，證實ADSCs-Sheet可以加快糖尿病潰瘍創面愈合，縮短愈合時間。以上結果顯示ADSCs-Sheet可以明顯加快創面愈合，但作為一種新型治療手段，暫時仍未有相關臨床研究。

3.4 ADSCs與支架復合移植：間充質干細胞具有較強的組織工程潛力，使其產生更高的移植率一直是人們不斷探索的目標，與此同時，出現了仿生基質和支架，它能夠為間充質干細胞提供一個附著、增殖及分化的結構基礎。目前常用的支架材料有：Ⅰ型膠原、纖維蛋白膠、透明質酸、絲素殼聚糖、人脫細胞羊膜、人脫細胞真皮基質等。動物實驗方面，羅鳴驁[42]利用殼聚糖支架負載SHH與ADSCs移植于小鼠背部后，發現注射區分化出大量新生血管內皮細胞。馬繼中[43]將ADSCs種植于人脫細胞基質羊膜支架上，再將ADSCs聯合人脫細胞基質羊膜縫合于創面之上，結果發現創面愈合時間明顯縮短。Altman，聶春磊等[44]用脫細胞真皮基質復合ADSCs，隨后將ADSCs脫細胞真皮基質復合物移植到小鼠的組織缺損上，結果表明移植后明顯加快肉芽組織形成及表皮再生，使創面愈合速度顯著提高。O'Loughlin等[45]將MSC接種于膠原支架中應用于糖尿病兔潰瘍模型發現，與未處理的傷口相比，接種MSCs處理的傷口血管生成明顯增多。本文未檢索出ADSCs復合支架用于糖尿病足的相關動物及臨床研究，其治療效果仍有待研究。

3.5 ADSCs移植的并發癥：脂肪栓塞是ADSCs移植嚴重的并發癥，可能導致中風、失明、局部皮膚壞死、偏癱、意識障礙，嚴重者甚至死亡[46]。有報道稱來源于糖尿病下肢血管缺血患者自體ADSCs移植后出現了2例血栓栓塞事件的發生（NCT01257776），這可能與糖尿病患者的自體ADSCs纖溶活性降低有關，這嚴重警示我們，在糖尿病患者中進行ADSCs移植治療中，需要警惕血栓形成方面的安全性問題[47]。

4? 小結及展望

綜上所述，糖尿病足潰瘍創面愈合是一個非常復雜的過程，它包括血管收縮，血塊凝固，炎癥反應，細胞遷移、增殖、分化，以及血管形成，上皮生成和細胞外基質的合成及重建等許多復雜的生理過程[48]，而脂肪干細胞在其中起到了明顯的積極作用。當前脂肪干細胞相關研究發展迅猛，在用于治療糖尿病足中也具有良好的效果，其優點有：①脂肪組織來源廣，大量獲取簡便[49];②自體干細胞移植，并不會發生免疫排斥反應;③創傷較小，操作簡易;④不用考慮倫理道德問題[25];⑤醫治效果確切，但必須嚴格挑選合適的病例。雖然ADSCs來源廣泛，獲取方法簡單，但是目前在糖尿病足的基礎和臨床研究領域仍然較少，其機制和安全性并不完全清楚，仍然需要我們更進一步的去探索這個未知領域。

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[收稿日期]2019-03-22

本文引用格式：張筱薇，徐剛.脂肪間充質干細胞在糖尿病足治療中的研究進展[J].中國美容醫學，2019，28（10）：165-170.