一例禽多殺性巴氏桿菌的分離與鑒定

黨媛

摘要：禽多殺性巴氏桿菌是引起各種禽類巴氏桿菌病的病原菌。禽巴氏桿菌病（即禽霍亂、禽出血性敗血癥）是一種急性、敗血性、接觸性傳染病，該病的流行具有發(fā)病快、病程短、發(fā)病率和死亡率高等特點。禽多殺性巴氏桿菌為條件性致病菌，當飼養(yǎng)管理突變、氣候突變、長途運輸等外界誘因出現時容易暴發(fā)，當前禽巴氏桿菌病常呈地方流行或散發(fā)流行，尤以成年雞最為常見。筆者對采集的一例疑似禽巴氏桿菌病的病料，通過病原菌分離培養(yǎng)、實驗室鑒定及藥敏試驗等研究，對疫情的診治提供了科學的依據，并針對當前多殺性巴氏桿菌臨床上的藥物濫用、耐藥性嚴重等問題進行簡要分析，旨在為各養(yǎng)殖單位健康發(fā)展提供參考。

關鍵詞：禽;多殺性巴氏桿菌病;分離;鑒定

中圖分類號：S831文獻標識碼：B文章編號：2095-9737（2019）10-0030-02

1?樣品來源與試劑

病料采自青海省西寧市某規(guī)模化養(yǎng)雞場疑似禽多殺性巴氏桿菌感染的病死雞肝臟組織。培養(yǎng)基及試劑主要有胰蛋白大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSA）、胰蛋白大豆肉湯培養(yǎng)基（TSB）培養(yǎng)基、新生牛血清、2×Taq PCR Master Mix、DNA Marker、革蘭氏染色液、細菌藥敏紙片等。

2?實驗室檢測

2.1?細菌分離培養(yǎng)

將采集的肝臟組織劃線接種于含2%新生牛血清的TSA平板、麥康凱平板上，37℃培養(yǎng)18 h后，觀察菌落形態(tài)，在TSA平板上出現淡灰白色、圓形、表面光滑、邊緣整齊、濕潤、半透明菌落，麥康凱平板上無菌落。挑取TSA平板上可疑單菌落傳代培養(yǎng)，并對典型的疑似菌落進行革蘭氏染色，油鏡下觀察細菌染色特點及形態(tài)，鏡下可見兩端鈍圓、兩極濃染、革蘭陰性小桿菌。

2.2?生化試驗

根據說明書，取分離菌株純培養(yǎng)物分別接種葡萄糖、麥芽糖、果糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、肌醇、VP、硫化氫、賴氨酸和鳥氨酸、尿素酶等生化管。生化試驗結果顯示該分離株可發(fā)酵葡萄糖、果糖、蔗糖、山梨醇，不發(fā)酵麥芽糖、乳糖、甘露醇、肌醇，VP、硫化氫、賴氨酸和鳥氨酸反應均為陰性，這與多殺性巴氏桿菌生化特征相符。

2.3?PCR鑒定

根據禽多殺性巴氏桿菌特異性基因kmt1設計引物進行PCR擴增鑒定。引物序列如下，P1：5'-AT CCGCTATTTACCCAGTGG-3'，P2：5'-GCTGTAAACGAACTCGCCAC-3'，擴增片段為456bp;挑取單個疑似菌落于100 μL無菌的ddH2O中，沸水中煮沸10 min，8000 r/min離心5 min，取上清液作為PCR模板;PCR體系為：2×Taq PCR Master Mix 10 μL、上下游引物各0.5 μL、模板1 μL，補滅菌水至20 μL，同時設立陰陽性對照，陽性對照選用標準株C48-2株（CVCC44802），反應條件為95℃預變性5 min，95℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸45 s，共30個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。反應結束后用1%的瓊脂糖凝膠板電泳，電泳結束后，取出凝膠板用凝膠成像儀進行成像分析，目的條帶的大小與預期相符，由此可以確定該場養(yǎng)雞場感染了禽多殺性巴氏桿菌。

2.4?藥敏試驗

采用Kirby-Bauer紙片擴散法對該分離多殺性巴氏桿菌株進行藥敏試驗，選擇包括青霉素、氨芐西林、阿奇霉素、阿莫西林克拉維酸、頭孢噻呋、頭孢克洛、氟苯尼考、恩諾沙星、大觀霉素、紅霉素、慶大霉素、克林霉素、阿米卡星、多西環(huán)素和多黏菌素B共計15種臨床常用的藥敏片。首先將純化后的分離菌均勻涂布到含2%新生牛血清的TSA平板上，再將15種藥敏片均勻分布到平板上，37℃培養(yǎng)18 h后，觀察并測量各藥敏紙片的抑菌圈直徑，進而對該多殺性巴氏桿菌分離株的藥物敏感性進行判定。結果顯示該分離菌對頭孢噻呋、頭孢克洛、氟苯尼考呈現高度敏感，對大觀霉素和多黏菌素B中敏，對阿奇霉素、多西環(huán)素低敏，其余耐藥。

3?討論

禽多殺性巴氏桿菌是禽霍亂的重要致病原，屬于條件致病菌，該菌可長期存在于禽鼻腔、呼吸道等處，當禽類機體抵抗力降低時感染發(fā)病，雞群一旦出現帶菌雞或染病雞，可通過被污染的飼料、飲水及環(huán)境等快速傳播，導致較高的發(fā)病率和死亡率，造成極其嚴重的經濟損失。本研究從疑似感染禽多殺性巴氏桿菌的規(guī)模化養(yǎng)雞場，隨機采集疑似病料，通過分離培養(yǎng)、染色鏡檢、生化試驗、PCR鑒定等，最終確定了該雞場感染了禽多殺性巴氏桿菌。并通過藥敏試驗對該分離株藥物敏感情況進行了鑒定，已將試驗結果反饋給相關養(yǎng)殖單位，通過及時的、科學的診治，疫情得到了很好的控制，現已完全恢復正常生產。

養(yǎng)殖過程中應堅持防優(yōu)于治的原則，加強飼養(yǎng)管理工作，不斷提高動物機體的免疫力，積極正確進行疫苗免疫，發(fā)揮疫苗的預防作用。多殺性巴氏桿菌根據莢膜抗原的不同可分為A、B、D、E、F五個血清型，且不同血清型之間缺乏交叉保護作用，目前多殺性巴氏桿菌病的預防多以滅活苗免疫為主，但因不同區(qū)域流行菌株之間血清型的差異，使得疫苗免疫效果不理想，常出現免疫動物仍感染發(fā)病。本次實驗涉及的養(yǎng)殖單位雖然管理規(guī)范，也實施開展了定期疫苗免疫，分析發(fā)病的原因可能是由于該株多殺性巴氏桿菌與免疫的滅活苗疫苗株有所差異，導致免疫失敗，確診后該養(yǎng)殖場用分離的多殺性巴氏桿菌株進行了自家苗的研制，并進行了免疫，取得了理想的預防效果。