大麥品種揚農(nóng)啤5號的黃花葉病抗性QTL定位

徐 肖，潘雨涵，沈會權(quán)，呂 超，郭寶健，王菲菲，許如根

(1.揚州大學(xué)江蘇省作物遺傳生理國家重點實驗室培育點/糧食作物現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心/教育部植物功能基因組學(xué)重點實驗室/揚州大學(xué)大麥研究所，江蘇揚州 225009； 2.江蘇沿海地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇鹽城 224001)

由大麥黃花葉病毒(BaYMV)和大麥溫和花葉病毒(BaMMV)引起的大麥黃花葉病主要危害中國冬大麥生產(chǎn)。BaYMV和BaMMV于冬季通過土壤禾谷多粘菌侵入大麥根部，再隨水分運輸至植株葉片，春季在葉片內(nèi)增殖破壞大麥葉片的葉綠體，使葉片呈現(xiàn)黃色花斑。不同大麥品種對病毒的抗性不同，病毒在葉片增殖的速度及破壞的程度不同，葉片的黃化程度也不同，葉片黃化會降低葉片的光合能力，削弱植株長勢，使植株矮化甚至死亡。大麥黃花葉病不但影響大麥產(chǎn)量，而且會降低籽粒品質(zhì)[1]。選育和推廣抗病新品種是防止大麥黃花葉病危害的最經(jīng)濟有效方法。大麥黃花葉病抗性基因來源廣泛，遍及大麥的7條染色體。已報道的大麥黃花葉病抗病基因有18個，僅Rym14Hb、Rym16Hb、Rym17為顯性基因，其他均為隱性抗病基因。其中，Rym14Hb和Rym16Hb來自于球莖大麥，分別位于6HS上和2HL末端，它們對歐洲病毒株系BaMMV、BaYMV-1及BaYMV-2[2-3]均具有抗性。位于3號染色體的Rym17來自于巴基斯坦的野生六棱大麥品種PK23-2，抗病基因rym18位于該品種的4號染色體，Rym17和rym18均能抗日本病毒株系BaYMV-Ⅰ和BaYMV-Ⅲ[4]。位于4號染色體長臂的rym1來自于抗病品種木石港3號[5]，高抗日本病毒株系BaYMV-Ⅰ、BaYMV-Ⅱ、BaMMV-Nal及BaMMV-Kal，中抗BaYMV-Ⅲ，對歐洲所有病毒株系均表現(xiàn)免疫[6-7]。位于7號染色體的rym2來自于日本抗病品種Mihori Hadaka 3[8]，高抗歐洲病毒株系BaMMV、BaYMV-1和BaYMV-2[9]。位于5H短臂的rym3來自于誘變材料Ea52[10]，高抗日本病毒株系BaYMV-Ⅰ、BaYMV-Ⅱ和BaYMV-Ⅴ，高感BaMMV[11]。位于3HL的rym4和rym5是一對等位基因[12]，rym4來自于克羅地亞的地方品種Ragusa[13-14]，抗歐洲病毒株系BaYMV-1和BaMMV，對BaYMV-2表現(xiàn)感病[15]；rym5來自于大麥品種Misato Golden[16]，對日本病毒株系BaYMV-Ⅰ、BaYMV-Ⅱ、BaYMV-Ⅳ和BaYMV-Ⅴ均具抗性[17]。位于3HL的rym6和rym10也是一對等位基因，rym6來自于抗病品種AmagiNijo，僅抗日本病毒株系BaYMV-Ⅱ，感歐洲BaYMV和BaMMV所有病毒株系[18]；rym10來自于德國抗病品種Heberna[19]，高抗歐洲病毒株系BaYMV-1和BaYMV-2[20]。位于1HS的抗病基因rym7，抗歐洲BaMMV病毒株系[21]。位于4號染色體長臂的端粒區(qū)的抗病基因rym8、rym9、rym12和rym13，rym8來自南斯拉夫大麥品種10247，抗歐洲BaYMV-1和BaMMV株系[22]；rym9來自抗病材料Bulgarian 347[23]，僅抗歐洲BaMMV病毒株系[22]；rym12來自于韓國抗病品種Muju covered 2，高抗歐洲所有病毒株系[24]；rym13來自于臺灣抗大麥黃花葉病品種Taihoku A，抗歐洲所有病毒株系[25-26]。位于4HL的rym11抗歐洲所有病毒株系[24]。位于6HS的rym15抗歐洲病毒株系BaYMV-1、BaYMV-2和BaMMV[27]。

我國長江中下游地區(qū)是大麥黃花葉病的高發(fā)區(qū)，寄主和病原菌相互作用，協(xié)同進(jìn)化，不斷產(chǎn)生新的病毒株系，導(dǎo)致育成品種抗性降低，嚴(yán)重影響大麥產(chǎn)量與品質(zhì)。因此，引入新的抗病基因、提高品種的抗病性是當(dāng)務(wù)之急。揚農(nóng)啤5號是揚州大學(xué)大麥研究所2005年育成的優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)多抗啤酒大麥品種，在江蘇等省廣泛推廣，對大麥黃花葉病抗性穩(wěn)定。本研究以揚農(nóng)啤5號和感病品種日引3號構(gòu)建的重組自交系(Recombinant indred lines, RIL)群體為材料，進(jìn)行抗性QTL定位，以期挖掘出新的抗病基因，為培育高抗優(yōu)質(zhì)大麥新品種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

以大麥黃花葉病高抗品種揚農(nóng)啤5號和感病品種日引3號構(gòu)建的253個重組自交系F6群體及親本為材料，所有材料均由揚州大學(xué)大麥研究所提供。

1.2 田間種植

分別于2013年、2014年和2015年秋季將參試材料種植于揚州大學(xué)大麥黃花葉病病圃，采用隨機區(qū)組設(shè)計，每個材料種植1行，行長1.2 m，行距0.2 m，每行點播40粒，3次重復(fù)。

1.3 抗性鑒定

在大麥黃花葉病發(fā)病初始階段對參試材料抗病性進(jìn)行調(diào)查和鑒定，每個材料連續(xù)調(diào)查10株，每隔7 d調(diào)查1期，連續(xù)調(diào)查3期。調(diào)查時期：2014年：2月22日、3月1日和3月8日；2015年：3月3日、3月10日和3月17日；2016年：3月1日、3月8日和3月15日。

參照黃培忠等[28]的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病情分級和抗性級別判定。

1級(高抗)—葉片呈正常綠色，無病斑；

2級(抗病)—葉片葉色基本正常，有黃花斑點，但斑點未連成線；

3級(感病)—葉片病斑的斑點連成線，葉片黃化，但植株不矮化；

4級(高感)—葉片出現(xiàn)大片黃花病斑，葉片黃化，植株萎縮、矮化甚至死亡。

選取病程梯圖下面積作為主要病情評價指標(biāo)。

病程梯圖下面積(Area Under the Disease Progress Stairs，AUDPS)：將多期病害調(diào)查值聯(lián)合起來，更準(zhǔn)確的評估病害的發(fā)病程度，AUDPS值越大，說明該品種(系)發(fā)病的嚴(yán)重度高、持續(xù)時間長。病程梯圖下面積計算公式：

其中，n為總調(diào)查次數(shù)，xi為第i次調(diào)查嚴(yán)重度，ti為第i次調(diào)查的時間。

1.4 多態(tài)性SSR標(biāo)記的篩選與RIL群體基因型分析

采用CTAB法[29]提取親本及重組自交系葉片的DNA。采用PCR技術(shù)和凝膠電泳技術(shù)，從1 176對大麥SSR引物中篩選親本間多態(tài)性SSR標(biāo)記，利用篩選獲得的SSR標(biāo)記對RIL群體進(jìn)行基因型分析。參照郝晨陽等[30]的方法進(jìn)行PCR和銀染。供篩選的1 176對大麥SSR引物中，31對GBM系列引物序列由德國IPK研究所提供，其余1 145對引物序列均為查詢Graingenes 2.0數(shù)據(jù)庫(https://wheat.pw.usda.gov/GG3/)獲得，由華大基因公司合成。

1.5 群體遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建

通過JoinMap 4.0軟件構(gòu)建RIL群體遺傳連鎖圖譜。

1.6 QTL定位

根據(jù)RIL群體3年9時期的大麥黃花葉病抗性表型，通過QTL IciMapping 4.0軟件完備區(qū)間-加性模型(ICIM-ADD)定位抗性QTL，將LOD值設(shè)定為2.5，計算每個QTL的貢獻(xiàn)率和加性效應(yīng)，參考Philn等[31]的方法命名QTL。

2 結(jié)果與分析

2.1 親本及RIL群體大麥黃花葉病抗性表現(xiàn)

由表1可知，在2014—2016年的9個調(diào)查時期內(nèi)，揚農(nóng)啤5號的大麥黃花葉病病級均為1級左右，表現(xiàn)為高抗，日引3號的病級均在3級左右，表現(xiàn)為感病。t測驗顯示，親本間大麥黃花葉病抗性差異均達(dá)極顯著水平。9個時期群體病級均值均介于雙親之間，并未出現(xiàn)超親或低親遺傳。RIL群體內(nèi)變異系數(shù)均大于15%，說明RIL群體內(nèi)大麥黃花葉病存在廣泛變異。

表1 親本及RIL群體病級的平均表現(xiàn)Table 1 The performance of population and parents to thedisease

**表示親本間在0.01水平上差異顯著。

** mean significant differences between Yangnonppi 5 and Riyin 3 at 0.01 level.

2.2 RIL群體的大麥黃花葉病抗性表現(xiàn)

2014—2016年RIL群體的AUDPS值均呈連續(xù)性分布，表明RIL群體的大麥黃花葉病抗性為數(shù)量性狀，符合QTL分析要求。由表2可知， 2014年RIL群體的AUDPS均值為28.53，遠(yuǎn)小于2015年和2016年，說明2014年RIL群體大麥黃花葉病的發(fā)病程度整體上輕于2015年和2016年；另外，分析RIL群體AUDPS值的變幅可知，不同年份間RIL群體大麥黃花葉病抗性均存在一定的差異，但基本介于雙親之間，重發(fā)病年份有少量的RIL系發(fā)病嚴(yán)重程度超過感病親本。

表2 親本及RIL群體的AUDPS值表現(xiàn)Table 2 The AUDPS performance of population and parents to the disease

2.3 RIL群體遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建

從1 176對大麥SSR引物中篩選獲得108對在雙親間具有多態(tài)性的標(biāo)記，采用108對SSR標(biāo)記對RIL群體進(jìn)行基因型分析，并通過JoinMap 4.0軟件構(gòu)建RIL群體遺傳連鎖圖譜(圖1)，發(fā)現(xiàn)該遺傳連鎖圖譜全長1 065.13 cM，標(biāo)記間的平均距離為9.86 cM。在大麥7條染色體上的分子標(biāo)記數(shù)均不相同，其中2H的標(biāo)記數(shù)最多，3H的標(biāo)記數(shù)最少，兩者分別有27個和8個(表3)；同時，連鎖圖中一些標(biāo)記間的距離仍較大，在今后的研究中還需進(jìn)一步加密標(biāo)記。

2.4 大麥黃花葉病抗性的QTL定位

根據(jù)RIL群體在2014—2016年9個時期的黃花葉病抗性結(jié)果，采用QTL IciMapping 4.0軟件完備區(qū)間-加性模型(ICIM-ADD)定位抗性QTL，結(jié)果共檢測到6個大麥黃花葉病抗性QTL(表4)。其中，1個QTL位于1H頂端，介于標(biāo)記區(qū)間ABC156B～UMB506，命名為qRYM-1H；3個QTL位于2H上，分別介于標(biāo)記區(qū)間EBmac0640～Bmag0744、GBM1309～EBmac0415和Bmag0745～EBmag0722，命名為qRYM-2Ha、qRYM-2Hb和qRYM-2Hc；1個QTL位于5H末端，介于標(biāo)記區(qū)間MGB357～CFE228，命名為qRYM-5H；1個QTL位于7H頂端，介于標(biāo)記區(qū)間Bmag0007～Bmag0206，命名為qRYM-7H。其中，qRYM-2Ha在2014-02-22、2016-03-08、2016-03-15三個時期均被檢測到；qRYM-2Hb在所有時期均被檢測到，說明這2個QTL穩(wěn)定性好。qRYM-2Ha和qRYM-2Hb分別可解釋 5.00%～ 10.88%和5.70%～14.64%的表型變異，其他4個QTL均只檢測到1次，是否真實存在尚需進(jìn)一步檢測。所有QTL的加性效應(yīng)均為負(fù)值，表明該群體的大麥黃花葉病抗性基因均來自母本揚農(nóng)啤5號。

表3 分子標(biāo)記在大麥染色體上的分布Table 3 The distribution of markers on different chromosomes of barley

圖1 大麥RIL群體遺傳圖譜Fig.1 Linkage map of RIL lines表4 大麥黃花葉病抗性的QTL在染色體上的位置及效應(yīng)分析Table 4 The positions of QTL and analyses of effects for resistance to barley yellow mosaic disease

年份Year日期DateQTL染色體Chromosome標(biāo)記區(qū)間Maker intervalLOD貢獻(xiàn)率Phenotypicvariance explained/%加性效應(yīng)Additive effect201402-22 qRYM-2Ha2HEBmac0640～Bmag07443.015.14-0.08 qRYM-2Hb2HGBM1309～EBmac04154.777.93-0.0903-01 qRYM-2Hb2HGBM1309～EBmac04153.779.28-0.15qRYM-5H5HMGB357～CFE2282.928.06-0.1403-08 qRYM-2Hb2HGBM1309～EBmac04155.1211.88-0.16201503-03 qRYM-2Hc2HBmag0745～EBmag07222.704.39-0.11 qRYM-2Hb2HGBM1309～EBmac04154.899.83-0.1603-10 qRYM-2Hb2HGBM1309～EBmac04157.0814.92-0.2503-17 qRYM-2Hb2HGBM1309～EBmac04153.155.70-0.16201603-01 qRYM-2Ha2HEBmac0640～Bmag07442.825.00-0.12 qRYM-2Hb2HGBM1309～EBmac04155.5614.64-0.2103-08qRYM-1H1HABC156B～UMB5062.789.14-0.13 qRYM-2Hb2HGBM1309～EBmac04153.359.31-0.13qRYM-7H7HBmag0007～Bmag02063.075.00-0.1003-15 qRYM-2Ha2HEBmac0640～Bmag07446.2710.88-0.14 qRYM-2Hb2HGBM1309～EBmac04152.606.18-0.10

3 討 論

3.1 揚農(nóng)啤5號大麥黃花葉病抗性基因位點的數(shù)量與效應(yīng)

本研究中RIL群體的6個大麥黃花葉病抗性QTL均來自于抗性親本揚農(nóng)啤5號，分別位于染色體1H、2H、5H和7H。其中，表現(xiàn)穩(wěn)定的位點qRYM-2Ha和qRYM-2Hb均位于大麥染色體2H，分別位于染色體2H的70 cM與160 cM。抗病基因Rym16Hb位于大麥2號染色體長臂末端，與RFLP標(biāo)記MWG949緊密連鎖，本研究檢測到的qRYM-2Hb與Rym16Hb位置相近[2]，可能是一對等位基因，但尚需進(jìn)一步驗證。qRYM-2Ha位點附近尚沒有大麥黃花葉病抗性基因報道，可能是一個新的抗性位點，這為該大麥黃花葉病抗性新基因的發(fā)掘、精細(xì)定位及克隆奠定了 基礎(chǔ)。

3.2 大麥黃花葉病抗性表型鑒定與抗性基因位點的穩(wěn)定性

大麥黃花葉病抗性主要受遺傳因素控制，不同年份、不同地點的溫度、濕度及土壤中黃花葉病病毒的株系類型及數(shù)量也直接影響大麥黃花葉病的抗性表現(xiàn)，進(jìn)而影響大麥黃花葉病抗性基因位點的穩(wěn)定性。本研究中，在2014—2016年的9個時期共檢測到6個大麥黃花葉病抗性QTL，但僅qRYM-2Ha和qRYM-2Hb具有較好的穩(wěn)定性，其他4個大麥黃花葉病抗性QTL均在某年份或某時期能檢測到，因此這4個QTL是否穩(wěn)定存在，還需進(jìn)行多年多點鑒定試驗。另外，本研究構(gòu)建的遺傳連鎖圖譜分子標(biāo)記數(shù)目偏少，對大麥黃花葉病抗性基因的定位存在一定的影響，后續(xù)研究還需進(jìn)一步增加分子標(biāo)記數(shù)目。

3.3 揚農(nóng)啤5號作為親本利用的前景分析

揚農(nóng)啤5號是揚州大學(xué)大麥研究所以品種如東6109為母本、蘇農(nóng)22為父本雜交選育的優(yōu)質(zhì)多抗高產(chǎn)啤用大麥品種，麥芽品質(zhì)達(dá)到國標(biāo)優(yōu)級，產(chǎn)量潛力達(dá)7 500 kg·hm-2，因其高抗大麥黃花葉病、白粉病，抗倒性強、耐鹽性好[32]，在江蘇、湖北、安徽等省大面積推廣，同時揚農(nóng)啤5號也被廣泛用作育種親本。揚州大學(xué)大麥研究所共配制雜交組合110多個，育成綜合性狀優(yōu)良品系10多個，其中選自(蘇引麥3號/揚農(nóng)啤5號)組合的蘇B0901品系分別于2014年和2015年經(jīng)江蘇和安徽農(nóng)作物品種審定委員會鑒定為高抗大麥黃花葉病優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)啤酒大麥新品種揚農(nóng)啤10號，2017年通過國家非主要農(nóng)作物品種登記，揚農(nóng)啤10號正在江蘇、安徽等省示范推廣[33]。另有來自揚農(nóng)啤5號親本組合的品系正在參加鑒定試驗，準(zhǔn)備登記。