關于高粱抗蚜基因定位的研究

黃為

摘? ?要：為害高粱的蚜蟲主要包括高粱蚜和麥二叉蚜，采用傳統農藥抗蚜的方式有諸多副作用，因此通過抗蚜基因定位來培育高粱抗蚜品種是最有效的抗蚜方法。通過構建感蚜品種Btx623雜交產生的子二代群體的96個單株進行全基因組SSR引物篩選和鑒定，最終挑選47對有多態性的SSR標記，構建了一張分子標記遺傳連鎖圖譜，并通過IciMapping軟件將基因型與抗蚜表型計算連鎖關系。研究結果表明，在二號染色體上找到兩個主效的QTL位點，分別位于S2-6與SSR-15、SSR-15與SSR-16之間，研究成果可以為高粱抗蚜的分子標記輔助育種提供理論指導。

關鍵詞：高粱;蚜蟲基因;QTL;SSR

過去十余年中，有關高粱抗蚜基因的研究一直不斷取得突破和進展。1982年，徐守珍等人鑒定了500余份國內外種質資源的抗蚜性，發現TAM428與Dubor2高抗高粱蚜。2002年，Katsar等人對蚜蟲抗性的研究發現至少10個位點位于8個連鎖群上，與蚜蟲生理型C、E、I和K抗性相關，抗性位點都來源于抗性親本TX278。2002年，李玥瑩等人以BTAM428×ICS-12B雜交后代建立的抗感群體為試材，設計特異性引物，將RAPD標記（隨機多態性DNA標記）轉化為SCAR標記（可對RAPD標記末端測序）得到了差異擴增的結果，從而為分子標記輔助育種提供了可靠的依據。2013年，王道文通過構建BTx623和HN16雜交產生子四代群體，證明顯性基因RMES1為抗蚜基因，位于6號染色體上。這些研究均提供了研究基礎，主要比較不同高粱個體的基因型與表型差異以及定位高粱的抗蚜基因[1]。

1? ?研究方法

1.1? ?研究思路

高粱共有10對染色體（2n=20），其基因組中含735Mbp。為了在其中尋找抗蚜基因，選擇通過SSR標記（近年來發展起來的一種以特異引物PCR為基礎的分子標記技術）進行QTL定位（數量性狀座位或者數量性狀基因座，是控制數量性狀的基因在基因組中的位置）。在每個染色體上選擇2～8處標記，共47對有多態性的SSR標記。一共獲取96份不同高粱葉片作為樣本，從中提取DNA模版，通過跑膠后所得的帶型與表型比對，選擇與表型一致或相似度最高的標記，即可得到與抗蚜基因連鎖最緊密的標記，而抗蚜基因必在該區間中，可計算重組率大致定位。

1.2? ?試驗儀器

剪刀、打樣機、微量移液器、恒溫箱、離心管、紫外/可見光分光光度計、PCR儀、玻璃板、齒梳、電源、回旋震蕩儀、IciMapping軟件等。

1.3? ?試驗材料

試驗材料以親本A6235（抗蚜）與BTx623（感蚜）雜交后所得的96株子二代作為試驗材料。試驗藥品選擇無菌蒸餾水、乙醇、液氮、CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）、氯仿-異戊醇、異丙醇、mix（含Mg2+、dNTP、DNA聚合酶）、電泳用膠、TBE（Tris硼酸）等。

1.4? ?試驗步驟

1.4.1? ?篩選標記

（1）篩選片段。選擇277對引物，將兩親本進行PCR、電泳，觀察親本多態性，篩選可做QTL標記的片段。QTL標記指的是控制數量性狀的基因在基因組中的位置。對QTL的定位必須使用遺傳標記，人們通過尋找遺傳標記和感興趣的數量性狀之間的聯系，將一個或多個QTL定位到位于同一染色體的遺傳標記旁。

（2）確定標記。根據帶型對比，選擇差異最為明顯的標記，最終在277對引物中篩選出47對作為標記。以每處標記為1組，共6組，進行后續試驗。

1.4.2? ?提取DNA

（1）取葉片。每剪取1片葉片后使用乙醇洗剪刀避免污染，并用液氮保存取下的葉片。

（2）打樣。將葉片與鋼珠放入打樣機中，以12000r/min共打樣40s。

（3）加入CTAB。用微量移液器向每管樣品中加入CTAB800μL，迅速振動。最后將所有樣品置于65℃的恒溫箱中放置60min，以破碎細胞。

（4）離心。用微量移液器向樣品中加入600μL24∶1的氯仿-異戊醇輕晃，以1000r/min離心10min，最終上層水相溶有DNA。

（5）沉淀。取1.5mL離心管，用微量移液器加入600mL異丙醇，使DNA析出為白色沉淀。在-20℃的環境下放置10min。

（6）洗沉淀。以10000r/min離心5min去上清液，用微量移液器加入800μL75%乙醇輕晃，以洗沉淀。

（7）風干。離心4min倒出乙醇，放入通風櫥晾干。

（8）加入100μL無菌蒸餾水，使用紫外/可見光分光光度計測所得DNA濃度。

1.4.3? ?PCR

（1）調配反應體系。向提取的DNA模版中加入水、左右引物與mix。

（2）準備解鏈。將所有樣品置于PCR儀中，條件為94℃、5min。

（3）徹底解開雙鏈。條件為94℃、30s。

（4）退火，結合引物。條件為55～58℃、30s。

（5）DNA聚合酶延伸（1000bp/min）。條件為72℃、30s。

（6）充分反應。條件為72℃、10min。

（7）在16℃環境下冷卻。

說明：第3～5步為1個循環，共需循環32～35次。

1.4.4? ?PAGE（核酸電泳）

（1）組裝模具。將兩塊洗凈的玻璃板拼接在一起，用適量膠封底。

（2）制膠。膠濃度為8%，100mL膠中含52.7mL水、26.6mL30%Acrylamide、20mL5×TBE、0.7mL10%過硫酸銨、0.065mLTEMED。

（3）注膠。將所制膠倒入玻璃板間，插上齒梳，等待凝固，并在模具架間倒入適量TBE作為緩沖液。

（4）點樣。用微量移液器向取下齒梳后形成的凹槽中滴入PCR后的樣本。

（5）電泳。將正負極連接上導線，接150V、3h。

（6）染色。取下玻璃板間凝膠后，浸泡在AgNO3溶液中20min，浸泡在NaOH溶液中20min，其間皆置于回旋式震蕩儀上震蕩。

（7）取膠，拍照。

2? ?研究結果與分析

分子標記遺傳圖譜如圖1所示，由IciMapping繪制，為高粱各染色體，其上標有所選標記;對得到的波峰數據分析，利用IciMapping繪制基因型和表型的連鎖關系，在log圖中尋找波峰，縱坐標LODScore≥2.5時，即視為該標記處存在QTL，抗蚜基因的可能性極高。由以上結果可知，在二號染色體上存在LODSCORE明顯高于2.5的QTL2個波峰。抗蚜基因定位（2號染色體）如圖2所示，放大二號染色體標記圖分析可知，兩抗蚜基因存在于S2-6與SS-15以及SSR-15與SSR-16之間。

利用QTL定位并比對基因型與表型的方法，在高粱二號染色體S2-6與SSR-15、SSR-15和SSR-16之間定位了2處抗蚜基因，從而有效防治蚜蟲危害。

參考文獻：

[ 1 ] 劉國慶，杜瑞恒，侯升林，等.高粱抗蚜研究進展[J].植物學報，2012，47（2）：171-187.

（收稿日期：2019-11-23）