離子色譜法檢測化妝品中L—羥脯氨酸方法研究

孫永澤 楊永超 馬曉星

摘 要：建立了一種離子色譜法測定含膠原蛋白類化妝品中L-羥脯氨酸的方法。采用Dionex? AminoPac? PA10 （2×250mm）分析柱，電化學檢測器，流動相為水- NaOH溶液-NaAc溶液，梯度洗脫，流速為0.25mL/min，柱溫為30℃。結果表明，在5 μg/mL～100 μg/mL范圍內，L-羥脯氨酸濃度與峰面積呈良好線性關系，相關系數R為0.9998，檢測限和定量限分別為0.15μg/mL和0.5 μg/mL。平均加標回收率為95.8%，RSD為3.4% （n=6）。此方法簡便、準確，可用于檢測膠原蛋白類化妝品的L-羥脯氨酸含量，為化妝品的常規檢測提供技術參考。

關鍵詞：L-羥脯氨酸；化妝品；離子色譜

膠原蛋白是膠原的水解產物，是動物結締組織中主要成分，也是哺乳動物體內含量最多、分布最廣的天然功能性蛋白，占蛋白質總量的25%～30%[1-2]。膠原蛋白具有良好的生物相容性、可生物降解性以及生物功能活性，因此，在食品、醫藥、組織工程、化妝品等領域獲得廣泛應用[3-4]。膠原蛋白在化妝品中添加量較低，樣品基質復雜，前處理繁瑣，因此其定量檢測一直是化妝品功效評價及質量監控的難點。L-羥脯氨酸（L（-）-hydroxyproline，L-Hyp）是一種非必需氨基酸，是膠原組織的主要成分之一，且為膠原中特有的氨基酸，約占膠原氨基酸總量的10%，膠原蛋白含量可以根據L-Hyp含量乘以相應系數得到，因此，檢測L-Hyp可反映膠原蛋白指標情況，例如，目前食品中膠原蛋白檢測主要以L-Hyp作為有效指標[5-6]。

目前L-Hyp的測定方法主要為氨基酸自動分析儀、液相色譜/質譜聯用法，但是該類設備相對昂貴。此外還有比色法、高效液相色譜法等，然而前者樣品處理相對較為繁瑣，且易出現假陽性現象，后者則需要對L-Hyp進行柱前衍生化，同樣繁瑣。因此，本文建立了一種離子色譜法（IC）檢測化妝品中L-Hyp的方法，避免了昂貴儀器的使用，同時也簡化了檢測流程，為化妝品中膠原蛋白類含量的確定提供了技術支持，進而為化妝品生產過程中的質量控制以及后期的功效評價服務。

1 實驗部分

1.1 主要儀器及試劑

Dionex ICS3000離子色譜儀（配電化學檢測器）；AminoPac PA10色譜柱（帶保護柱）（Thermo Fisher）；Millipore超純水儀；氮吹儀。

L-羥脯氨酸標準品（純度>99%）；NaOH（Alfa Aesar 50%氫氧化鈉）；醋酸鈉（sigma-aldrich）；濃鹽酸（12 mol/L，德國Merck公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品前處理

稱取樣品0.5 g（精確值0.1 mg）至安瓿瓶中，加入10 mL 6mol/L鹽酸，氮吹3min后迅速熱封；將安瓿瓶置于110 ℃恒溫烘箱中水解22 h，水解產物轉移至50 mL容量瓶，用超純水定容至刻度。取1 mL定容后的水解液于40 ℃氮吹至干，加入1～2 mL超純水繼續氮吹至干，最后用1 mL 0.1mol/L鹽酸復溶，0.22 μm濾膜過濾后上機。

1.2.2 標準曲線制備

精密稱取L-羥脯氨酸標準品50 mg于50mL容量瓶中，用0.1mol/L鹽酸定容至刻度得標準品儲備液。分別取50μL，100μL，200μL，500μL，1000μL標準儲備液于10mL容量瓶中，用0.1mol/L鹽酸定容，制得系列濃度為5μg/mL，10μg/mL，20μg/mL，50μg/mL，100μg/mL的標準溶液。

1.2.3 色譜條件

色譜柱：AminoPacPA10氨基酸專用分析柱（2×250 mm），保護柱（2×50mm）；流動相：A：超純水；B：250mmol/LNaOH溶液；C：1mol/L醋酸鈉溶液；流速：0.25mL/min；進樣量：25μL；柱溫：30℃；洗脫程序見表1。

2 結果與討論

2.1 方法考察

2.1.1標準曲線、檢出限和定量限

按1.2.2制備標準曲線，上機檢測。以標準品濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線，線性回歸方程為：y=4.7226x+79.891，R2=0.9998。結果表明，L-羥脯氨酸在5μg/mL～100μg/mL范圍內呈良好線性關系，見圖1。

2.1.2 重復性

取20 μg/mL標準品溶液6份，按1.2.1方法處理后上機檢測，結果見表3，測得結果的相對標準偏差RSD為2.62%，表明該方法重復性良好。

2.1.3 樣品加標回收率

選取已知L-羥脯氨酸含量的某市售化妝品，精密稱取6份，分別加入20?g/mL標準品溶液1mL，充分混合后按1.2.1方法處理后上機檢測，記錄峰面積，根據線性方程計算樣品中L-羥脯氨酸含量，得出相應回收率。結果表明，L-羥脯氨酸回收率在91.3%～98.9%，平均回收率為95.8%，相應的測定結果的RSD為3.4%（n=6）。該方法準確度良好。

2.2 樣品測試

選取8個市售含膠原蛋白類化妝品樣品，按本方法進行檢測，結果見表4。羥脯氨酸作為膠原和膠原蛋白中的特殊蛋白質，其含量一般約為膠原氨基酸總量的10%，其含量是目前食品、保健品及動物組織中膠原和膠原蛋白定量的常用換算方法。因此，本方法以10為折算系數，計算化妝品中膠原蛋白含量（見表5）。從表中看見，這些宣稱含有膠原蛋白的樣品中所含膠原蛋白含量參差不齊，甚至有的含量為0，因此，消費者選購時需要注意。

3 結論

本文闡述了一種離子色譜檢測化妝品中L-羥脯氨酸的方法，該方法靈敏度高，無需衍生化，無需昂貴的氨基酸自動分析儀，操作簡單，可應用于含膠原蛋白類化妝品的檢測和質量控制，為化妝品功能性成分日常檢測提供技術參考。

參考文獻：

[1] Hulmes DJ.Building collagen molecules，fibril，and suprafibrillar structures. J Struct Biol，2002，37（1-2）：2-10.

[2] Jerome AW，John AMRl.Immunology of collagen-based biomaterials.In：Donald LW.Biomaterials and bioengineering handbook.Marcel Dekker.Inc.USA，2000：739-760.

[3]王旭楠，郭立群，周潔，等.高效液相色譜法測定化妝品中膠原蛋白含量[J].日用化學品科學，2018，41（8）：10-13.

[4]蔡梅，吉文亮，劉華良，等，氨基酸自動分析儀對牛乳中羥脯氨酸快速測定方法研究[J].中國食品衛生雜志，2012， 24（6）：542-545.

[5]蔡偉江，陳曉霞.液相色譜—串聯質譜法測定保健品中L-羥脯氨酸含量[J].食品安全質量檢測學報，2015，6（02）：667-672.

[6]王旭波，徐利麗，鄭潔，等.柱前衍生化-HPLC法測定市售3種膠類藥材中L-羥脯氨酸和膠原蛋白的含量[J].中國藥房，2017，28（27）：3824-3827.