細菌內毒素檢查法中凝膠法在藥品中的應用及經驗總結

劉小靜　王亞婷

摘 要：本文主要介紹細菌內毒素檢查法中凝膠法的原理、操作及注意事項，因凝膠法實驗過程時間短，消耗樣品量少，且使用設備簡單，費用低等優點，并作為《中國藥典》“仲裁”檢查方法，廣泛用于注射劑藥品細菌內毒素檢查。

關鍵詞：細菌內毒素;凝膠法;注射劑藥品

細菌內毒素作為外源性致熱原的內毒素能激活中性粒細胞等，是革蘭陰性菌細胞壁個層上的特有結構，會使中性粒細胞釋放一種叫內源性熱原質的物質，其在體溫調節的中樞會引起發熱反應。當內毒素經消化道進入人體不會產生危害，但內毒素經注射液等方式進入血液時則引起癥狀不同的疾病。因此，藥品安全性檢驗一個重要項目就是藥品注射劑中細菌內毒素檢查。美國科學家Levin和Bang1968年建立鱟試驗法來檢查細菌內毒素，美國FDA于1973年制定的規則指出“鱟試劑是一種檢測細菌內毒素的靈敏指示劑。”

1 鱟試劑的特性及與內毒素產生反應的作用機理

鱟試劑是細菌內毒素檢查法中最重要的試劑。它是鱟科血細胞（變形細胞）裂解液的凍干產物。鱟的血液中只有一種類型的血細胞參與循環就是被稱為變形細胞。目前制備細胞鱟試劑一種是東方鱟，另一種是美洲鱟。研究鱟試劑作用機理表明，細菌內毒素激活鱟試劑中鱟血細胞溶解物，產生一系列的凝集酶反應，形成凝固蛋白凝膠。判斷供試品中細菌內毒素的限量能否在規定范圍，可通過用鱟試劑檢測，或者是量化革蘭陰性菌所產生細菌內毒素。

2 細菌內毒素檢查法

2.1內毒素標準品

細菌內毒素國家標準菌株由大腸桿菌提煉精制而成，是用來檢查，校準，仲裁鱟試劑靈敏度、細菌內毒素濃度測定，干擾測試和測試方案中供試品陽性對照和陽性對照溶液的制備和光度測定方法的可靠性測試、凝膠檢查鱟試劑試驗敏感性。國家標準是細菌內毒素校準的參照標準，單位為內毒素（EU），1EU等于1國際單位內毒素（IU）。

2.2 實驗準備

玻璃器皿在酪酸洗液、其他熱源性滅活劑、或清洗劑將充分浸泡，控干洗液后用蒸餾水3遍以上的沖洗，放入干燥箱，在250℃干烤30min以上，用以除掉可能性存在外源性內毒素干擾。如果用塑料的器具，如微孔板和與微量加樣器配套的吸頭等，應選用標明無內毒素并且對試驗無干擾的器具。

2.3 鱟試劑靈敏度復核

將細菌內毒素采樣標準品與專門的檢查水在渦流攪拌器中混合溶解15min，稀釋后測定鱟試劑的靈敏度值（λc）。每一批新批次鱟試劑全部需嚴格采用靈敏度試驗。

2.4 實驗方法

將8支鱟試劑分別加入細菌內毒素檢查用0.1mL水溶解。按最大稀釋倍數稀釋的供試品溶液0.1mL加入2支，作為供試品溶液管，2支加入含內毒素濃度為2λ對照溶液為供試品陽性對照管，2支加入2λ內毒素工作標準品溶液0.1mL作為陽性對照管，2支加入細菌內毒素檢查用水0.1mL作為陰性對照管。試管混勻封口置于37℃±1℃恒溫器中保溫60分鐘±2分鐘，從恒溫器中慢慢取出，極緩的倒轉180°，若未形成凝膠，或者形成凝膠不堅實、變形體從管壁下滑脫落為陰性;管內出現凝膠并且凝膠不變形、如果不從管壁下滑脫落即為陽性。拿取或者保溫試管時要避免振動，以免出現假陰性檢測結果。

2.5實驗注意事項

準備工作：肥皂洗手，用75%乙醇棉球消毒。應在清潔環境中進行操作，取樣時防止混入氣體，并防止微生物污染移液管。

3 干擾試驗的必要性

鱟試劑凝聚反應是一種二價陽離子酶反應體系，有許多干擾反應的物質會干擾凝膠的形成。在新樣品測定中，必須首先進行細菌內毒素干擾試驗，確定是否存在干擾樣品出現縮合反應的因素。為了保證所選處理方案能夠在不滅活內毒素情況下有效消除干擾，采用預先添加的標準內毒素再處理液進行干擾試驗。

4 可能會出現的異常結果及其原因和解決方法

4.1 造成呈假陰性的可能原因及解決方法

原因可能是：①內毒素工作標準中存在的一些問題，如滴度標注不準確，過期或貯存不當導致失效，稀釋誤差或稀釋振蕩不夠，對照管沒有達到2λ陽性內毒素濃度;②問題出在鱟試劑。例如，過期失效，振蕩不當，靈敏度標注不準確，會產生氣泡，鱟試劑酶蛋白變性，鱟試劑破壞;③溫控器溫度不符合要求或保溫時間不夠。

解決辦法包括：規范內毒素標準效價的審查和鱟試劑在保質期正確儲存和使用的敏感性;內毒素稀釋應準確，確保PC管添加2λ內毒素;當使用可溶解的鱟試劑時，沿著管壁慢慢加水，讓混合器振蕩30s。避免劇烈振動產生氣泡，確保恒溫器溫度和保溫時間正確。

4.2 造成假陽性的可能原因及解決方法

原因可能包括：實驗設備受到污染，經熱原、外源性內毒素或微生物污染不能完全滅活;試驗中由于誤操作造成的內毒素污染;BET水不符合要求，內毒素超標，培養溫度不正確等。解決方案包括：按照2015年版《中國藥典》的規定對實驗儀器進行處理;選擇合格的BET水，確保正確的培養溫度、時間和操作。

總而言之，細菌內毒素檢查法已被列入許多國家藥典。方法學研究表明，用細菌內毒素法取代家兔熱原法的藥物種類較多，因為它比家兔熱原法更精準、快速、簡捷、經濟、容易推廣等諸多優點。

參考文獻：

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