藍玉簪龍膽ITS序列克隆與遺傳分化分析

孫姍姍 王廷峰

摘 要：藍玉簪龍膽為龍膽屬的常見種之一，青藏高原特有物種。本研究通過對藍玉簪龍膽6個個體進行ITS序列的克隆與測序，得到8條序列，長度為644～651bp，包含48個堿基突變和11個缺失/插入，共鑒定出7個單倍型。通過克隆序列構建藍玉簪龍膽及其近緣物種線葉龍膽的系統發育樹，2個物種可形成2個支系，但藍玉簪龍膽大部分單倍型仍鑲嵌在線葉龍膽支系內。本研究獲得的藍玉簪龍膽ITS序列及其分化分析為龍膽屬進化研究提供了參考。

關鍵詞：藍玉簪龍膽;ITS;克隆;遺傳分化

中圖分類號：S-3 文獻標識碼：A ??DOI：10.19754/j.nyyjs.20191030005

引言

龍膽屬植物是典型的高山植物，以青藏高原及其周邊地區為分布中心和分化中心[1，2]。藍玉簪龍膽（Gentiana veitchiorumHemsl.）多年生草本，生長于海拔4000～5000m的草甸或灌叢中，隸屬于龍膽屬多枝組，是青藏高原特有植物，也是多枝組中的常見物種，是高山草甸的重要組成部分。藍玉簪龍膽花色素雅，形態優美，具有較高的園藝觀賞價值，已被用于園藝栽培。進化研究表明，藍玉簪龍膽的葉綠體基因組存在基因缺失[3]，目前缺乏其群體遺傳學研究[4]。

青藏高原是全球生物多樣性熱點地區之一，是維管束植物的多樣性中心之一，是我國植物資源重要的“基因庫”，有很高的生物多樣性。同時，青藏高原具有數量眾多的特有種，比如龍膽屬、虎耳草屬、杜鵑花屬和馬先蒿屬等類群。此外，青藏高原的植物在研究植物區系起源和演化具有重要價值，整個東亞植物區系至少在其西部是以橫斷山至喜馬拉雅為中心而發展起來的。

隨著分子生態學的發展，結合遺傳結構與歷史地質事件，解決物種的種群歷史演化過程及成因。在進化生物學中，ITS序列，即18S-5.8S-26S 核糖體DNA的基因內轉錄間隔區（nuclear ribosomalInternal Transcribed Spacer），是十分常用的分子標記。高等植物的核糖體DNA由18S rDNA、ITS1、5.8S rDNA、ITS2和26S rDNA組成，再由成百上萬個基本單元串聯成重復序列。ITS序列作為核基因分子標記有如下優點：被子植物的ITS長度穩定，一般在600～700bp間;基因序列比較保守，設計的通用引物在不同物種中均可擴增;進化速率較大，可提供豐富的系統發育信息，是重要的Barcoding標記，能較好的反應種間關系。其在種內居群也往往存在豐富的變異，可用于群體遺傳學研究。因此，ITS已經成為被子植物分子系統學和群體遺傳研究中應用最廣的核基因分子標記。此外，ITS還可以用于檢測雜交事件，推測親本序列，在揭示雜交等復雜進化過程中具有重要作用。

本研究以藍玉簪龍膽的3個居群為研究對象，通過對部分個體進行單克隆測序，探討藍玉簪龍膽ITS序列的基本特征及其與近緣種的遺傳分化，研究結果將為龍膽屬植物的進化研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

在四川和西藏的高山草甸上采集藍玉簪龍膽3個居群（Fu2016036，四川色達;Fu2016175，西藏芒康;Fu2017207，西藏林周）6個個體，憑證標本保存在洛陽師范學院生命科學學院標本館。樣品采集，保證居群內每個個體間距至少10m，以防止克隆體;選擇開花的成熟植株，選取幼嫩的葉子用干燥硅膠快速干燥，密封保存于-20℃中。

1.2 DNA提取、PCR擴增與序列克隆

通過CTAB法[5]從干燥的植物葉片中提取總DNA，用1%瓊脂糖檢測提取質量。選用通用的ITS1a-ITS4引物[6]，擴增體系和擴增反應見表1。將PCR產物用EZ-10柱式膠回收試劑盒（Omega，廣州）回收純化，1%瓊脂糖電泳檢測，用分光光度計NanoDrop 2000 （Thermo Scientific）測定濃度后，進行pMD 18-T載體（Takara， 大連）在16℃連接4h，5ul反應體系為：載體50ng，PCR純化產物20ng， Solution I 1.0ul。連接后的產物與E. coli DH5α感受態細胞（Takara， 大連）感受態細胞按說明書進行標準的轉化程序，隨后在平板上做藍白斑篩選，37℃過夜培養。挑取陽性單克隆在LB培養基中培養3～5h后對菌液做PCR檢測，反應體系和擴增程序見表1。將陽性克隆搖菌，用EZ-200 柱式試劑盒（生工，上海）提取質粒，用BigDye v3.1（Applied Biosystems， USA）和ABI3730xl（Applied Biosystems， USA）測序。

1.3 數據分析

所得測序結果在軟件GENEIOUS PRO 3.5.6[7]中查看測序峰圖并逐一進行人工校對，通過比對去掉載體序列，隨后進行數據整理和比對。將比對后的序列經格式轉換后，在軟件DnaSP 5.1[8]中統計單倍型個數。從GenBank下載藍玉簪龍膽的近緣種線葉龍膽的76條ITS克隆數據（MN124292-MN124367）與藍玉簪龍膽現有序列（AY858677），采用最大似然法，在IQ-TREE[9]中基于單倍型構建藍玉簪龍膽和線葉龍膽的系統發育樹。系統樹構建采用的核苷酸替換模型由IQ-TREE自動計算。選用Ultrafast方法[10]進行bootstrap計算，設為5000次。以龍膽屬秦艽組的麻花艽（MF579734）、粗莖秦艽（MF506958）為外類群。

2 結果

2.1 序列特征

本研究對來自3個居群的6個個體進行基因克隆與測序，共得到8條ITS序列，長度為644～651bp。其在59個位置存在變異，包含48個堿基突變，11個缺失/插入（表2），共鑒定出7個單倍型（GenBank No. MN128583-MN128589）。在48處堿基突變中，2種堿基間的突變有47處，3種堿基間的突變有1處;缺失/插入的堿基片段長度從1～9bp。在鑒定出的8個單倍型中，僅有1個單倍型在多個克隆中共享，剩余單倍型均為單個克隆特有。共享的1個單倍型分布于6207種群的2個個體中。

2.2 遺傳分化

本研究中，共得到藍玉簪龍膽8條ITS序列，共鑒定出7個單倍型，表現很高的雜合性。與線葉龍膽76條ITS序列構建系統發育樹可分為2個支系，一個支系包括藍玉簪龍膽的2個單倍型（V_6，V_7），另一個支系為線葉龍膽的全部以及藍玉簪龍膽剩余的5個單倍型（圖1）。系統樹基部節點的支持較高，內部的支持率大部分均低于60%（圖1中未標注部分）。此外，值得注意的是從GenBank上下載的藍玉簪龍膽ITS序列，其在系統發育樹中與外類群聚在一起，而并未與該物種及其近緣種線葉龍膽的序列聚成一個大支。

3 總結

ITS序列是最常用的分子標記之一，被廣泛用于系統發育樹的構建和群體遺傳結構分析。由本研究可知，藍玉簪龍膽ITS序列存在高度雜合性。雖然本研究的樣品有限，但在651bp長度的序列中，仍然存在48個堿基突變和11個缺失/插入。然而，如果不經過序列克隆直接進行測序，在居群內能鑒定出的變異位點非常有限。此外，系統發育樹重建的結果表明，不經過序列克隆直接測序得到的序列在系統發育樹中與外類群聚在一起，并未與藍玉簪龍膽及其近緣種線葉龍膽的克隆序列聚成一個大支，雖然可能是由于樣品產地不同導致的地區間的遺傳分化，但也從一定程度說明克隆測序得到的序列與直接測序得到的序列在進化分析中可能存在結果不一致的情況。因此，對于ITS序列存在高度雜合的物種，深入的單克隆測序工作是有必要的。

藍玉簪龍膽與線葉龍膽是2個形態分化明顯的物種，具有顯著的形態分化，例如線葉龍膽的蓮座葉叢小或者沒有、莖生葉為線形、花為天藍色，而藍玉簪龍膽的蓮座葉叢大、莖生葉為橢圓形、花為深藍色。然而，用分子片段ITS 難以將這2個物種區分開，說明2個物種的遺傳分化尚不完全，是近期物種形成的產物，符合龍膽屬在近期快速分化的事實[2]。雖然藍玉簪龍膽形成了1個支系，且系統發育樹基部節點的支持率較高，但多數藍玉簪龍膽的單倍型仍內嵌在線葉龍膽支系之中。由于龍膽屬是一個近期快速分化的類群[2]，物種間的遺傳分化較小，給近緣物種的區分增加了難度，有待用更大數據量如二代測序技術加以區分。

參考文獻

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作者簡介：

孫姍姍，講師。研究方向：植物適應性進化。

基金項目：洛陽師范學院培育基金（項目編號：2018-PYJJ-009）