水產品中喹諾酮類獸藥殘留檢測研究進展

劉海生

（廣東省清遠市動物疫病預防控制中心廣東清遠511500）

關鍵字：水產品；喹諾酮類；殘留檢測；處理方法

喹諾酮類抗微生物藥是在近幾十年開始發展起來的一類人工合成的廣譜抗微生物藥，從第一個喹諾酮類抗微生物藥——萘啶酸開始，人們不斷改造和開發此類藥物，因為這類藥物具有獨特的抗微生物機制，即抑制微生物DNA 拓撲異構酶的活性，從而抑制微生物DNA 復制，最終導致微生物死亡。這種獨特的抗菌機制讓這類藥物與其他抗微生物藥物之間基本不存在交叉耐藥現象，所以此類藥物可與其他抗菌機制的藥物聯合使用，從而增強治療效果。

隨著人們生活水平不斷提升，人們的消費觀念和消費水平都有了很大的改變，由于水產品相較于其他動物源性食品具有其特有的營養組分和獨特風味，水產品在人們飲食方面上越來越重要。據有關部門統計，2017 年全國水產品養殖總量為6,573.82 萬噸，占世界水產養殖總量的70%，如此龐大的市場潛力之下隱藏著的食品安全問題也是需要高度重視的。目前，我國和歐盟都對水產品中部分喹諾酮類藥物要求有最高殘留限量（見表1），但是水產品中獸藥殘留檢測的研究還不夠深入，尤其是同時進行多個或多種藥物的檢測方法研究上，因此在多獸藥殘留檢測的方法上還需要更進一步研究，尤其是在檢測方法的靈敏度、穩定性、時效性的研究上。

表1 歐盟和中國農業部規定的最高殘留限量

1 喹諾酮類藥物理化性質

喹諾酮類藥物屬于4-喹諾酮-3-羧酸的衍生物，其化學結構式如下圖所示。

圖1 4-喹諾酮-3-羧酸結構

根據不同藥物的化學結構式的母環結構之間的不同，這類藥物可以分為萘啶酸類、吡哌酸類、喹啉酸類及氟嗪酸類，4 種類型的化學結構分別如下：

注：由A 至D 依次為萘啶酸類，吡哌酸類，喹啉酸類，氟嗪酸類。

喹啉酸類是目前研究得最多、成果最大，種類也最多的喹諾酮類藥物，這類藥物具有抗菌作用較強，口服吸收快，血藥濃度較高，體內分布廣等特點。大多數喹諾酮類藥物在化學結構上的C-3 位上含有羧基基團，C-7 位上含有哌嗪或其他含氮的堿性基團，因此大多數喹諾酮類藥物屬于酸堿兩性化合物。在中性溶液中，喹諾酮類藥物一般被溶解成3 種離子形式，即陽離子、陰離子以及兩性離子。正是由于這種特殊的化學結構，喹諾酮類藥物容易被極性有機溶劑溶解，如乙腈、甲醇，也容易溶于冰醋酸、稀酸溶液和稀堿溶液，而在極難溶或不溶于非極性溶劑，如水、正己烷、甲苯和乙醚等溶劑。

2 喹諾酮類藥物殘留檢測的樣品前處理方法

在水產品中的獸藥殘留檢測中，樣品的前處理方法主要包括提取溶劑和凈化方法兩個方面，根據喹諾酮類藥物的理化性質，在此類藥物殘留檢測中，提取溶劑主要選擇以下幾種溶劑：

1)與水互溶的極性有機溶劑，如乙醇、乙腈、甲醇、丙酮等。一般情況下這類溶劑能夠直接把喹諾酮類藥物提取出來。當出現提取效果不好的時候，可以在提取溶劑中加入一定比例的酸或堿，如乙酸、甲酸、氫氧化鈉等，加入酸或堿的目的可能是可以改變藥物電離，以促進藥物分配至有機溶劑中；

2)緩沖鹽溶液，如用磷酸緩沖溶液、檸檬酸緩沖溶液等直接浸提；

3)不與水互溶的有機溶劑，如乙酸乙酯，原理同萃取原理，一般同時加少量入酸性或堿性溶液來提高藥物在有機相的分配比例。

在藥物的提取過程中，水產品樣品含有較多的雜質物質，如脂肪、蛋白質、干擾離子等，這些雜質物質也會溶解在提取劑當中，如果不經過凈化過程極可能對實驗結果造成偏差，甚至還會對分析儀器造成嚴重影響，因此提取藥物后需要經過一定的凈化過程。

在水產品的獸藥殘留檢測研究中，常選用的凈化方法有液-液萃取法(LLE)、固相萃取法(SPE)、凝膠滲透色譜法、免疫親和色譜法、超臨界流體萃取法、分子印跡法等，各種方法優缺點如表2 所示[1]。各種樣品凈化方法具其獨特優點，在選擇方法時需要根據樣品的性質和檢測目標藥物的性質來選擇最優的凈化方法，以達到最佳檢測效果。

表2 部分凈化方法比較

3 水產品中喹諾酮類藥物檢測方法

目前喹諾酮類藥物殘留的檢測方法主要有對儀器和人員要求較低的微生物法、高效毛細管電泳法 (high performance capillary electrophoresis,HPCE)和免疫分析法(immunoassays,IAs)，以及對儀器和人員要求較高的高效液相色譜法（high performance liquid chromatography,HPLC）、液相色譜-質譜聯用法(liquid chromatography tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)、高效免疫親和色譜法等。對儀器和人員要求較低的方法一般用于定性分析或者用于對檢測結果不要太精密的檢測，如用于多樣品的初次篩選，而對儀器和人員要求較高的方法一般用于要求精確的定量分析。

3.1 微生物法

微生物法是一種利用指示菌株檢測抗菌藥物殘留量的快速檢測方法。抗微生物藥物對敏感微生物具有良好的殺滅或抑制效果，但當抗微生物藥物的濃度低到一定程度后，這種效果將表現不出來。這種方法的原理就是利用藥物敏感微生物所表現的程度強弱會形成不同大小的抑菌圈，而這種抑菌圈與藥物含量之間具有直接的相關性。另外由于這種方法的操作簡單，實驗耗時少，可同時檢測大批量樣品，因此常用作畜禽產品和水產品中藥物殘留的快速檢測初篩方法。但是由于檢測可能會出現假陽性結果，所以出現陽性結果的樣品需重復檢測，或是結合其他檢測方法確定檢驗結果。

3.2 高效液相色譜法

高效液相色譜法是1960 年開始發展起來的一門技術，它具有色譜柱分離效率高、分析速度快、待檢測樣品用量少、靈敏度高、自動化程度高等特點，還可以將分離、分析一次完成。目前在獸藥殘留檢測上已經建立了許多分析方法，其中又以反相液相色譜為主。在反相液相色譜方法中，可以根據目標檢測藥物的特性選擇合適的流動相，并通過改變流動相的組份比例、pH，或通過加入離子對試劑等方法以優化流動相的組成，從而控制保留時間和選擇性[2]。

待檢測樣品經過液相色譜分離后，即可利用合適的檢測器進行分析檢測，常用的液相色譜檢測器有紫外檢測器、熒光檢測器、二極管陣列紫外檢測器以及可見分光光度檢測器等。由于喹諾酮類藥物對波長處于250～320 nm 范圍內的光有吸收，故一般選擇紫外檢測器用于檢測此類藥物，另一方面紫外檢測器是通用型檢測器，適用于多類藥物的分析檢測。但是由于HPLC 對于多殘留檢測的藥物種類數目有一定局限性，或對于性質相近的物質分離效果不佳，故此方法常用于單種或是少種數的藥物殘留分析[3]。

3.3 液相色譜-質譜聯用法

液相色譜-質譜聯用法是運用液相色譜（LC）的分離原理對組份進行分離后，再以質譜儀（MS）作為檢測器進行檢測。這種方法對分析目標物要求不高，常用于直接分析和鑒定獸藥、農藥、蛋白質、多糖等物質。在獸藥殘留檢測中，這種方法適用于檢測極性、大分子、高沸點、不揮發或熱不穩定的各類獸藥，喹諾酮類藥物完全可以用這種方法檢測，而且不需要經過衍生化處理即可檢測。這種方法具有選擇性強、靈敏度高和可以同時檢測多種藥物殘留等優點，所以喹諾酮類藥物的多殘留檢測和研究經常使用這種方法。值得一提的是質譜儀除了可以與液相色譜串聯使用外，還可以與高效液相色譜或是超高效液相色譜(UPLC)串聯使用，從而增加色譜柱分離效果，提高檢測效率[4-5]。

3.4 高效毛細管電泳法

毛細管電泳法是在近年來開始發展起來的一項新的實驗分析技術，這種方法可以避免酸性或堿性的緩沖液以及其中的表面活性劑等添加劑的影響，具有操作簡單、分析速度快、分離效率高、樣品用量少、運行成本低等優點[6]，而且色譜柱不會被樣品污染，有利于實際樣品的分析。但這種方法的檢測限較高，且因進樣量較小而不利于靈敏度的提高，因此目前HPCE 法較少用于獸藥殘留分析。

3.5 免疫分析法

免疫分析法是利用抗原與抗體在體外的特異性反應建立起來的檢測技術，其特點是特異性高，簡單快捷，檢測成本相對較低，可以大批量檢測，但是出現假陽性的可能性較大，所以免疫分析法在實際應用中常常被作為初步篩選的方法[7-8]。

4 總結

喹諾酮類藥物在臨床使用上抗菌譜廣、價格低廉、使用方便，以及抗菌機制獨特等特點，對預防和治療多種由細菌、支原體及衣原體等引起的感染性疾病很有效果。然而，喹諾酮類藥物在食品性水產中的殘留可直接對人類造成危害，此外長期大量使用這類藥物造成的低濃度的殘留藥物可能會對敏感致病菌產生耐藥性，從而間接威脅到人類的健康。雖然我國已經出臺了相關政策規定不得在水產養殖中使用一些喹諾酮類藥物，但是由于這類藥物良好的臨床使用價值，仍會有養殖者不按休藥期使用，導致水產品中含有的喹諾酮類藥物超過最高殘留限量，甚至還有不法養殖者鋌而走險使用水產養殖禁用藥，所以對水產品中喹諾酮類藥物進行殘留檢測具有很重要的現實意義。

在水產品中喹諾酮類藥物殘留檢測方法中，實用性最好的是高效液相色譜法，但這種方法檢測成本較高，也需要有專業的檢測人員來完成檢測，所以在實際檢測中，可以結合免疫分析法進行初步篩查后對超出殘留限量的樣品再用高效液相色譜進行檢測，以確定樣品中的藥物殘留量。█