莫沙必利聯合米曲菌胰酶片對功能性消化不良模型小腸Cajal間質細胞的影響及其機制的研究*

李偉冬,江舒曼,賈 林

(廣東省廣州市第一人民醫院消化內科 510180)

Ⅳ診斷標準將功能性消化不良(FD)定義為起源于胃十二指腸的癥狀[1]，其病因復雜，病程遷延，復發率高，嚴重影響患者生存質量。國內FD的發病率約20%，其門診量占消化專科的60%～70%[2]。國內外已有不少研究報道莫沙必利聯合米曲菌胰酶片治療FD，能夠影響患者胃腸激素的表達水平，改善患者胃動力障礙，但關于其內在機制的研究報道極少。有報道認為核因子-κB(NF-κB)的激活可以促進影響胃腸道損傷的炎性因子的表達水平上調，在FD的發病機制中起到了關鍵性的作用[3]。本研究設想莫沙必利聯合米曲菌胰酶片可通過影響NF-κB的表達，調控一系列促炎細胞因子及胃腸激素的表達水平，從而達到治療FD的效果。本研究構建了Cajal間質細胞(ICC)FD模型[4]，并檢測了莫沙必利和米曲菌胰酶片單用及聯用治療前后細胞胃腸激素及NF-κB等促炎因子的表達變化，初步探索其作用機制，希望能為進一步的臨床研究提供實驗基礎并為FD治療提供新的治療靶點，現報道如下。

1 材料與方法

1.1實驗動物 Balb/c小鼠及SD大鼠由南方醫科大學實驗動物中心提供，生產許可證號：SCXK(粵)2016-004。培養在溫度為22 ℃、濕度為60%～70%的環境中，每天12 h光照/黑暗交替，自由攝食。

1.2方法

1.2.1原代小鼠小腸ICC培養、鑒定及分組 選用Balb/c小鼠5只，雌雄不限，禁食24 h后處死；取出小腸，于顯微鏡下剝離小腸黏膜層后，將小腸組織剪成碎片；將Ⅱ型膠原酶(批號1202775，美國Gibco公司)加入盛有小腸碎片組織的燒杯中，于37 ℃消化30 min,離心，用Hank′s液(批號12350039，美國Gibco公司)重懸沉淀，過200目篩除去大塊組織；用M199培養基(批號1302027，美國Gibco公司)培養細胞，放入5% CO2，37 ℃條件下培養，隔天換液，繼續培養。將ICC放置于顯微鏡下觀察細胞形態學變化；通過免疫熒光的方法檢測原代培養ICCc-kit的表達來鑒定ICC[4-5]。

1.2.2FD大鼠模型及細胞模型的構建 40只SD大鼠分成正常動物組，10只，造模后予生理鹽水2 mL灌胃，3次/天；FD動物模型組，10只，造模后予生理鹽水2 mL灌胃，3次/天；莫沙必利動物組，10只，造模后予莫沙必利(瑞琪，江蘇豪森藥業)灌胃，每天劑量0.27 mg/kg，3次/天；米曲菌胰酶片動物組，10只，1片米曲菌胰酶片(慷彼申，德國NORDMARK ARZNEIMITTEL GmbH & Co.KG公司)溶于6 mL溫開水，造模后分3次使用，時間同Ⅲ組；聯合治療動物組，10只，造模后予莫沙必利及米曲菌胰酶灌胃，劑量與次數同Ⅲ、Ⅳ組。除正常組外，其余4組大鼠都采用夾尾刺激引發大鼠打斗法進行FD造模，造模7 d后開始給藥，連續10 d灌胃后處死并制備相應血清。

用含有5%胎牛血清的全成分細胞培養液培養ICC24 h，使其同步化。將制備好的對應正常細胞組(A組)、FD細胞模型組(B組)、莫沙必利組(C組)、米曲菌胰酶片組(D組)及聯合治療組(E組)血清，按組別加入ICC培養瓶中培養24 h，收集細胞用于后續實驗。

1.2.3檢測方法 按說明書利用ELISA方法(武漢華美生物)檢測各組ICC上清液中胃動素(MTL)、胃泌素(GAS)、P物質(SP)、5-羥色胺(5-HT)、白細胞介素(IL)-1β、IL-6、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和一氧化氮(NO)的水平。利用免疫熒光染色和共聚焦顯微鏡(德國Leica公司)觀察NF-κB在各組細胞中的表達分布。利用實時熒光定量PCR(RT-PCR)方法檢測各組處理后的ICC上清中NF-κB激酶抑制因子(IKK)、NF-κB和NF-κB抑制因子(IκB)基因mRNA的表達水平。

2 結果

2.1原代ICC形態及免疫熒光鑒定結果 熒光顯微鏡下見大多數原代ICC的胞體呈現紡錘形或星形，細胞核多為圓形且體積較大，約占所有細胞的2/3，胞體邊緣較為清晰，有3～5個明顯的突起且突起相互間存在聯系，形成網狀結構。隨著細胞培養時間的延長，ICC形態特征更加突出。原代培養ICC在熒光顯微鏡下可見明顯的c-kit陽性信號，見圖1。

2.2FD細胞模型 A組ICC整體呈紡錘形，細胞邊緣突起較多，且突起間相互連接成網，細胞核較大，細胞邊緣清晰可見；B組FD模型ICC整體趨向扁平化，細胞突起較少，網狀結構受損，細胞間縫隙明顯縮小，見圖2。

圖1 熒光顯微鏡下原代ICC形態(免疫熒光染色，×400)

2.35組胃腸激素及炎性因子表達水平比較 與A組比較，B組MTL、SP、5-HT的表達水平明顯降低，GAS、NO、IL-1β、IL-6和TNF-α的表達水平明顯升高(P<0.05)；與B組比較，C組MTL和5-HT表達水平明顯上升，GAS、IL-1β和TNF-α的表達水平有所下降(P<0.05)。D組SP和5-HT表達水平較B組明顯升高且NO、IL-6和TNF-α表達水平明顯下降(P<0.05)；與C、D組比較，E組MTL、SP、5-HT的表達水平均明顯升高，GAS、NO、IL-1β、IL-6和TNF-α的表達水平均明顯降低(P<0.05)，見表1。

2.45組NF-κB(p65)表達分布情況 免疫熒光結果顯示：與A組比較，B組NF-κB的表達明顯上升；而與B組比較，C、D、E組NF-κB的表達均有所降低，其中E組降低最為明顯(P<0.05)，見圖3。

A:A組;B:B組

圖2熒光顯微鏡下ICC形態(免疫熒光染色，×400)

表1 各組胃腸道激素和炎性因子的表達

a：P<0.05，與A組比較；b：P<0.05，與B組比較；c：P<0.05，與C組比較;d：P<0.05，與D組比較

A～E:A～E組

圖3 5組NF-κB(p65)表達分布情況(免疫熒光染色，×400)

a：P<0.05，與A組比較；b：P<0.05，與B組比較；c：P<0.05，與C組比較;d：P<0.05，與D組比較

圖4 5組IKK、IκB、NF-κB(p65)mRNA表達

2.55組IKK、IκB、NF-κB(p65)mRNA表達水平比較 與A組比較，B組血清中的IκB mRNA的表達水平較低，而IKK、NF-κB mRNA的表達水平較高(P<0.05)。與B組比較，C、D組IκB mRNA表達水平較高，而IKK、NF-κB mRNA的表達水平較低(P<0.05)；E組IκB mRNA的表達水平較高，而IKK、NF-κB mRNA的表達水平較低，且較C、D組差異更為明顯(P<0.05)，見圖4。

3 討論

FD的發病因素眾多，包括上消化道運動障礙、內臟高敏感性、胃酸分泌過多、幽門螺旋桿菌感染、社會、心理、飲食等諸多因素，其中胃腸道動力障礙和內臟高敏感性被認為是其主要病理基礎[6]，也有多項研究及羅馬Ⅳ標準強調幽門螺旋桿菌感染因素的重要性[1，7-8]。

胃腸激素是參與消化道機械運動、消化液分泌等生理活動的肽類激素，主要包括MTL、GAS、CGRP、Ghrelin等，其與相對應受體結合后可通過調控神經遞質的合成與釋放參與到胃腸機械運動的調節作用中，其表達水平與FD的發生、發展密切相關[9-11]。研究證實NF-κB信號途徑可能參與胃腸激素的合成與分泌，其激活可以上調胃腸道損傷的炎性因子水平，在FD的發病機制中起關鍵作用[2,12-14]。莫沙必利及米曲菌胰酶片在臨床上已被廣泛用于治療包括FD在內的一系列功能性胃腸病[15-17]。國內外已有不少文獻報道莫沙必利聯合米曲菌胰酶片治療FD，能夠影響患者胃腸激素的表達水平，有效改善患者胃動力障礙，從而緩解FD癥狀。本研究檢測了FD細胞模型中部分胃腸激素(MTL、GAS)及神經遞質(SP、5-HT)的表達情況，并研究了莫沙必利、米曲菌胰酶片單獨治療及聯合治療前后MTL、GAS、SP、5-HT的表達變化。結果顯示，經莫沙必利或米曲菌胰酶片單獨處理后，MTL、SP、5-HT的表達水平均得到一定程度的恢復，而在莫沙必利和米曲菌胰酶片兩者聯合處理之后MTL、SP、5-HT得到更大程度的恢復。表明兩者聯合處理的治療效果強于各自單獨治療，可以起到協同作用，且兩者很可能通過改善胃腸激素的表達來發揮其治療作用。核轉錄因子NF-κB的激活可以促進影響胃腸道損傷的炎性因子表達水平上調，被認為在FD的發病機制中起到了關鍵性的作用。因此，本研究猜測莫沙必利聯合米曲菌胰酶片是否是通過影響NF-κB的表達，進一步調控一系列促炎細胞因子的表達水平，改善胃腸激素的失衡，從而達到治療FD的效果。本研究在ICC上建立了FD細胞模型，發現NF-κB信號通路被激活，經莫沙必利或米曲菌胰酶片單獨處理后，NF-κB信號通路得到一定程度的抑制，而在莫沙必利和米曲菌胰酶片聯合處理之后，NF-κB信號通路被抑制的程度更大。由此可以推測莫沙必利聯合米曲菌胰酶片治療FD的分子機制，可能是通過抑制NF-κB信號通路，下調炎性反應因子的表達，從而恢復相關胃腸道激素和神經遞質的表達水平。

綜上所述，莫沙必利和米曲菌胰酶片聯合治療對FD模型大鼠中失調的胃腸激素及炎性因子具有明顯調節作用，聯用效果較單藥治療更為明顯。本實驗從細胞水平對莫沙必利聯合米曲菌胰酶片治療FD的機制進行研究，試驗結果與眾多臨床試驗相印證；從NF-κB信號通路與胃腸激素合成釋放的關系切入，充分探討了聯合治療的作用機制，為進一步臨床研究提供條件。