氫質子磁共振波譜活體檢測結腸癌耐藥性及其分子標志物的探索

謝琦，陳惠嫻，杜磊，廖炎輝，譚智霖，楊逸銘，吳敏儀，潘奇鋒，，吳錦斌，，張鼎旋，

磁共振波譜分析(magnetic resonance spectroscopy，MRS)是利用化學位移理論與磁共振技術相結合，定量分析人體內特定化合物濃度的一種無創傷性MRI檢測技術。利用MRS可檢測出腫瘤產生多藥耐藥性前后某些代謝物的變化，對檢測腫瘤耐藥性改變的分子標志物可能起到重要作用。本研究探索氫質子磁共振波譜(1H-MRS)活體檢測人類結腸癌耐藥性的可能。

1 材料與方法

1.1 動物模型制作

1.1.1 人類結腸癌SW480/5-FU耐藥細胞系的建立[1]

人類結腸癌SW480親本細胞系(購自中山大學動物中心細胞庫)用完全新鮮培養液于37℃，5% CO2孵箱中培養。

采用大劑量沖擊法誘人類結腸癌SW480耐藥細胞株：SW480親本細胞處于對數生長期時， 將培養液換為含有6μg/mL 5-FU的培養液，沖擊培養24 h撤藥，換為正常完全培養液繼續培養，1～2 d換液一次，待細胞重新恢復正常增殖，生長至對數生長期時進行傳代，傳代后繼續以此濃度劑量沖擊培養誘導耐藥細胞株，培養6個月，獲得能夠在6 μg/mL 5-FU濃度中穩定生長的人類結腸癌SW480耐藥細胞株，命名為SW480/5-FU。

MTT比色法檢測人類結腸癌親本SW480、耐藥SW480/5-FU細胞IC50，耐藥指數(resistance index，RI)=SW480/5-FU IC50∶SW480 IC50=20.594 μg/mL∶4.639μg/mL=4.44。

1.1.2 實驗動物模型制作[1]

16只健康的BALB/c裸小鼠，雌性，5～6周，16～18 g，隨機分為兩組(各8只)，用安爾碘消毒后，分別于裸鼠雙側大腿根部皮下注入SW480(不耐藥組)與SW480/5-FU (耐藥組)細胞懸液(0.2 mL/只，細胞濃度為4×107/mL)，定期觀察腫瘤生長情況，取最大徑大于1.5 cm以上的腫瘤進行磁共振檢查。

1.2 荷瘤鼠MR檢查[1]

采用SIEMENS公司MAGNETOM Skyra-3.0 T超導型磁共振成像儀與動物線圈(上海辰光)行以下序列檢查。

1.2.1 T2WI快速自旋回波

TR/TE=4500 ms/110 ms，層厚2 mm，間隔0，FOV 128 mm，NAS 4，加速因子2，采集矩陣128×128，重建矩陣512×512，行軸位、冠狀、矢狀位成像，成像時間=2 min 2 s (圖1)。

1.2.21H-MRS數據采集

采用PRESS序列，譜線帶寬1000 Hz，翻轉角90°，手動勻場、抑水；多體素三維容積采集(3-demensional multi voxel，3D MV)：TR/TE=1700 ms/135 ms，層厚2 mm (根據腫瘤大小調整)，間隔0，FOV 60 mm，VOI 30 mm，采集體素邊長10 mm，NAS 8，采集矩陣128×128，重建矩陣512×512，成像時間=9 min 13 s (圖2)。

1.2.3 數據處理

1H-MRS所得數據經西門子磁共振成像儀工作站處理，結合T2WI軸位和冠狀位定位像，得到圖像上能最大范圍覆蓋腫瘤的采集體素生成MRS譜線圖，系統自動計算出所測代謝物的波峰下面積及其與肌酸峰下面積比值。檢測的代謝物有：膽堿(choline，Cho)、乳酸(lactate，Lac)、谷氨酸-谷氨酰胺復合物(glumate+gultamine，Glx)、肌醇(inositol，Ins)、肌酸(creatine，Cr)。

1.3 標本的實驗研究

BALB/c裸小鼠于磁共振檢查完畢后，向其腹腔注射10%水合氯醛處死，切開裸鼠腫瘤部位皮膚，將腫瘤全部掏出，即放入無菌冰生理鹽水中，磁共振數據采集側腫瘤一分為二，一部分放入緩沖4%多聚甲醛，供石蠟包埋切片及細胞凋亡檢測；另一部分腫瘤組織放入液氮罐中，供Western blot檢測P-gp、MRP1、PKC、γ-GCSh、γ-GCSl、GSHS、GST蛋白表達。

HE染色結果分析：病理切片由兩位病理科醫師分別按同一標準在偏光顯微鏡下閱片分析，取兩位醫師所采集的均值為病理的檢測最終結果數值。

Western blot檢測由廣州杰特偉生物科技有限公司完成。所用抗體：羊抗小鼠IgG/HRP (Abclonal)，M D R 1(A 11 7 5 8，A b c l o n a l)；M R P 1(A 3 0 2 7，Abclonal)；PKC(A0267，Abclonal)；GST(2624S，CST)；GSS(A1069，Abclonal)；GCLM(A5314，Abclonal)；GCLC(Ab190685，Abcam)。所檢測代謝物膠片掃描入電腦，用凝膠圖像處理系統Image J分析條帶凈光密度值，計算蛋白表達光密度比RIOD。

1.4 統計學分析

采用SPSS 13.0 統計學軟件進行統計學處理，數據用±s表示，兩組之間比較均采用Mann-Whitney U檢驗，相關性分析均采用Spearman相關檢驗，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

耐藥組與非耐藥組分別有8個腫瘤最大徑線為1.5 cm以上。

2.1 腫瘤代謝物的1H-MRS檢測

腫瘤組織Cho、Lac、Glx、Ins與Cr峰量化結果見表1。耐藥組Cho峰、Lac峰、Glx1峰、Glx2峰面積及Ins/Cr峰面積比均較不耐藥組增加，兩者差異有統計學意義(P＜0.05，表1)。

表1 耐藥組與不耐藥組腫瘤1H-MRS檢測面積量化分析結果(±s)Tab.1 Results of quantit ative analysis of 1H-MRS measure area in drug-resistant tumor and drug- response tumor (±s)

表1 耐藥組與不耐藥組腫瘤1H-MRS檢測面積量化分析結果(±s)Tab.1 Results of quantit ative analysis of 1H-MRS measure area in drug-resistant tumor and drug- response tumor (±s)

組別 Cho Lac Ins/Cr Glx1 Glx2 Glx1/Cr Glx2/Cr不耐藥組(n=8) 0.94±0.47 0.60±0.14 1.42±0.26 1.38±0.10 0.64±0.21 2.35±0.34 1.18±0.39耐藥組(n=8) 2.89±0.92 1.92±0.29 3.99±0.96 2.88±0.62 0.90±0.35 5.36±0.36 1.75±0.53 Z值 2.611 2.611 2.611 1.964 2.193 1.091 1.358 P值 0.008 0.008 0.008 0.049 0.032 0.275 0.222

表2 SW480組與SW480/5-FU組蛋白表達RIOD值的比較(±s)Tab.2 Comparison of RIOD values of protein expression between SW480 and SW480/5-FU (±s)

表2 SW480組與SW480/5-FU組蛋白表達RIOD值的比較(±s)Tab.2 Comparison of RIOD values of protein expression between SW480 and SW480/5-FU (±s)

組別 p53 P-gp MRP1 PKC γ-GCSh γ-GCSl GSHS GST不耐藥組(n=8) 0.26±0.07 0.20±0.03 0.15±0.01 0.16±0.02 0.18±0.02 0.15±0.00 0.28±0.33 0.12±0.02耐藥組(n=8) 0.39±0.03 0.31±0.08 0.69±0.10 0.86±0.06 0.43±0.26 0.34±0.07 1.37±0.07 0.42±0.07 Z值 1.687 2.611 2.785 2.668 2.643 2.712 2.635 2.627 P值 0.095 0.003 0.005 0.008 0.008 0.007 0.008 0.008

圖1 荷瘤鼠腫瘤的T2WI橫斷位(A)、矢狀位(B)及冠狀位(C)成像 圖2 荷瘤鼠腫瘤的1H-MRS波譜曲線Fig. 1 T2WI transverse (A), sagittal (B) and coronal (C) imaging of tumors in tumor-bearing mice. Fig. 2 1H-MRS spectrum of tumors in tumor-bearing mice.

圖3 SW480組織切片(左)和SW480/5-FU組織切片(右)Fig. 3 SW480 tissue section (left) and SW480/5-FU tissue section (right).

2.2 腫瘤標本實驗檢測

2.2.1 腫瘤組織的壞死

HE染色切片顯示SW480與SW480/5-FU腫瘤組織壞死區域范圍差距不明顯；SW480/5-FU細胞核較SW480大，并且細胞間排列更緊密，細胞密度較大(圖3)。

2.2.2 腫瘤組織蛋白表達(Western blot)檢測

耐藥組與不耐藥組P-g p、M R P 1、P K C、γ-GCSh、γ-GCSl、GSHS、GST蛋白表達情況見表2。耐藥組P-gp、MRP1、PKC、γ-GCSh、γ-GCSl、GSHS、GST表達量均較SW480組增加，兩組之間表達差異有統計學意義(P＜0.05，表2)。

2.3 腫瘤組織1H-MRS檢測代謝物與腫瘤細胞蛋白表達的相關性

腫瘤Cho峰面積與腫瘤P-gp (r=0.636，P=0.048)、MRP1(r=0.821，P=0.004)、γ-GCSh (r=0.841，P=0.002)、γ-GCSl(r=0.799，P=0.006)表達呈正相關。腫瘤Lac峰面積與腫瘤P-gp (r=0.806，P=0.005)、γ-GCSh (r=0.730，P=0.017)表達呈正相關。腫瘤Ins/Cr面積比與腫瘤P-gp (r=0.770，P=0.009)、PKC (r=0.762，P=0.010)表達呈正相關。腫瘤Glx1面積與腫瘤MRP1(r=0.880，P=0.021)、GST (r=0.888，P=0.018)表達呈正相關。腫瘤Glx2面積與腫瘤MRP1(r=0.847，P=0.0 0 2)、γ-G C S h (r=0.6 4 4，P=0.0 4 4)、γ-GCShl(r=0.780，P=0.008)、GSHS (r=0.661，P=0.038)表達呈正相關。

3 討論

結直腸癌(colorectal cancer，CRC)早期無臨床癥狀，出現癥狀時，病變常已是中晚期，治療方法主要以5-氟尿嘧啶化療為主的綜合治療，但因對化療藥出現耐藥性，使結直腸癌的死亡率居高不下。據美國癌癥協會估計，死于不同程度的耐藥的腫瘤患者占90%。所以，及時檢測結腸癌耐藥性、調整治療方案已經成為結直腸癌治療成功與否的關鍵因素[2-3]。

目前臨床和實驗室評價腫瘤耐藥性的方法有CCK-8法、MTT法、ATP-TC法、流式細胞監測和TECIA法等[4-5]，需要采集腫瘤組織標本，難以用于臨床常規監測。腫瘤是一個分化不均質、多形性細胞群體，這些方法僅能反映采集部位腫瘤組織的耐藥情況，不能準確反映腫瘤整體的耐藥性。部分檢查方法需時較長，腫瘤組織離開體內后某些生物代謝物可能發生變化，不能反映體內腫瘤的真實情況。因此，探討便捷、可靠、能活體評價腫瘤耐藥性的方法顯得非常必要。

為探討上述問題，本研究模擬臨床化療中的沖擊療法，對結腸癌SW480腫瘤細胞進行大劑量沖擊，經6個月的反復間斷在培養液中加入5-FU，獲得能夠在6 μg/mL 5-FU濃度中穩定生長的人類結腸癌SW480耐藥細胞株，RI為4.44。用結腸癌SW480親本細胞和耐藥結腸癌細胞SW480/5-5-FU制作的裸鼠移植瘤模型，后者的腫瘤組織細胞的耐藥相關蛋白P-gp、MRP1、PKC的表達明顯高于前者，說明研究所獲得SW480/5-FU腫瘤組織對5-FU的耐藥性真實可靠。

人體組織的化合物在特定的條件下可產生化學位移，1H-MRS可采集這種位移所產生的峰值，并通過計算化合物共振峰的面積或峰高，對組織內某種化合物的含量進行量化分析[6]。1H-MRS是現今已用于臨床、可以活體檢測組織內代謝物狀態的影像學方法，可以檢測體內代謝活動所導致的化合物的改變[6-10]。本研究使用1H-MRS活體檢測結腸癌SW480親本和5-FU耐藥的荷瘤鼠腫瘤組織代謝物Cho、Lac、Glx、Ins與Cr的改變情況，對比兩者代謝物變化的差異。

Cho峰位于3.21 ppm，成分包括膽堿、磷脂酰膽堿、磷酸膽堿類等，反映被檢測組織內總的膽堿含量，與磷脂代謝活動密切相關，而磷脂雙分子層作為構成細胞膜的基礎；測定Cho能間接反映組織細胞膜代謝的活躍程度[6-9]。本研究發現，SW480/5-FU腫瘤組織中Cho面積較親本SW480腫瘤組織高，兩組之間存在顯著性差異(P＜0.05)；HE切片顯示SW480/5-FU腫瘤細胞密度明顯增高，細胞間隙縮小；腫瘤Cho峰面積與腫瘤P-gp、MRP1、γ-GCSh、γ-GCSl等耐藥相關的基因及酶的表達呈正相關。推測可能隨著耐藥性的增長，腫瘤細胞的代謝活動進一步活躍，細胞膜的轉運功能增強同時其合成、分解速率也可能加快，最終致使Cho的增加。

Cr波峰分別存在于3.02 ppm和3.94 ppm處，主要由肌酸和磷酸肌酸。人體三磷酸腺苷(adenosine triphophate，ATP)含量不足時，Cr通過釋放高能磷酸鍵的方式，使ATP能夠加速合成以供給能量，Cr的高低反映細胞能量代謝狀態。由于其體內Cr的量在各類病理生理情況下均相對穩定，因此常將Cr峰作為參照物，評價其他各種代謝物的改變[6]。Ins波峰位于3.56 ppm處，是細胞內磷脂酰肌醇的前體物質，而磷脂酰肌醇是信號轉導通路中的一種途徑，參與肌醇-三磷酸循環[6]；它是一種與細胞膜的更新和細胞磷脂層結構有關的物質，因此任何一種形式的細胞膜更新的加快或細胞膜磷脂層的破壞都可以導致Ins濃度的升高[11]。Ins常參與PKC的激活，而PKC對腫瘤的侵襲性有調節作用，是耐藥相關蛋白。研究表明惡性度高或侵襲性強的原發性腦腫瘤內可發現PKC增高[12]。本研究發現，SW480/5-FU組與親本SW480/腫瘤組織比較，Ins/Cr面積明顯增高(P＜0.05)，PKC蛋白表達明顯增多；腫瘤Ins/Cr面積比與腫瘤P-gp、PKC表達呈正相關。這說明MRS活體監測Ins/Cr的變化可能作為活體檢測腫瘤耐藥性的分子標志物。

Lac峰出現在1.33 ppm，由于雙自旋作用，表現為雙尖峰。正常組織一般情況下不出現Lac峰，但在一些情況，如缺血缺氧、炎癥、代謝性異常等狀態下，可產生大量的乳酸產物而出現Lac峰[6，8]。腫瘤組織代謝旺盛，并且即使在有氧環境下仍然持續的發生糖酵解反應，最終生成大量代謝產物乳酸。而乳酸的聚集與腫瘤多藥耐藥(multiple drug resistance，MDR)存在密切關系，因臨床大多數化療藥物呈弱堿性，大量的乳酸所電離出的氫離子能中和藥物中的氫氧根離子，使其不易穿透細胞膜，從而導致腫瘤MDR[13]。此外，腫瘤酸化耐藥機制還可能與P-gp有關，Thews等[10]把前列腺癌細胞培養于酸性培養基數小時以后，結果顯示P-gp活性加倍，但表達不變，提示酸性條件能誘導P-gp產生更高傳輸速率。本研究結果顯示，SW480/5-FU組織中的Lac峰面積明顯高于不耐藥的SW480；腫瘤Lac峰面積與腫瘤P-gp、γ-GCSh表達呈正相關。因此，Lac的變化能從活體組織酸堿度的層面作為評價腫瘤耐藥性的分子標志物。

Glx峰位于2.1～2.4 ppm及3.65～3.8 ppm處，包括谷氨酸和谷氨酰胺，由于兩者存在復合重疊的J偶聯共振，常難以區分開[6，8，14]。Glx作為谷胱甘肽(glutathione，r-glutamyl cysteingl+glycine，GSH)的前體物質，參與了細胞氧化還原平衡的調節，Glx峰的增高常見于組織嚴重缺氧狀態[6，8，14]。大量研究證實GSH的增加能使腫瘤細胞抵抗來自放療或化療的自由基損傷，導致腫瘤耐藥[15]。本研究發現與不耐藥組結腸癌移植瘤相比，耐藥組移植瘤的Glx1、Glx2峰面積更高，兩者之間存在顯著性差異(P＜0.05)；腫瘤Glx1面積與腫瘤MRP1、GST表達呈正相關，腫瘤Glx2面積與腫瘤MRP1、γ-GCSh、γ-GCShl、GSHS表達呈正相關。可見Glx1、Glx2峰可以反映腫瘤細胞耐藥相關的谷胱甘肽代謝狀態，可能成為活體監測腫瘤耐藥性的生物標志物。

本研究尚存在不足：本研究僅觀察一種耐藥程度SW480/5-FU (RI為4.44)的活體監測情況，下一步將繼續培養不同耐藥程度的結腸癌細胞，動態觀察不同耐藥性的磁共振參數變化，以觀察相應代謝物與耐藥相關性的穩定性和重復性。此外，本研究樣本量較小(n=5)，尚需擴大樣本量重復實驗研究，研究腫瘤體積較小，結構成分復雜，固定體素的大小限制使其難以完全排除部分容積效應，可能對結果有一定的影響。

綜上所述，1H-MRS檢測代謝物中，耐藥組移植瘤Cho、Lac、Glx1、Glx2面積及Ins/Cr面積比明顯高于不耐藥組移植瘤，兩者之間差異有統計學意義(P＜0.05)。因此，1H-MRS通過檢測的腫瘤內代謝物變化，有可能對活體評價結腸癌耐藥與否具有重要意義。

利益沖突：無。