標記指導大規模混合家系選育技術應用實例

魯翠云，李超，曹頂臣，匡友誼，鄭先虎，李崇文，孫效文

（1.中國水產科學研究院黑龍江水產研究所，黑龍江 哈爾濱 150070;2.天津市天祥水產有限責任公司，天津 301500）

近年來，鯉Cyprinus carpio、鯽Carassius auratus、草魚Ctenopharyngodon idellus、鰱Hypophthalmichthys molitrix 和鳙Aristichthys nobilis 等我國主要養殖魚類基因組資源迅速積累，相繼開發了大量的共顯性標記，建立了遺傳連鎖圖譜，發掘出了與重要經濟性狀相關的數量性狀位點（QTL）標記。孫效文等[1]將分子育種技術定義為在群體、家系或個體選擇中使用了基因或標記的育種技術。按照其觀點，我國主要養殖魚類均具備了開展分子育種研究的條件。利用分子標記揭示親本個體間的遺傳差異，指導繁殖配組的分子育種技術已經在鯉[2]、牙鲆Paralichthys olivaceus[3]、紅鰭東方鲀Takifugu rubripes[4]、大黃魚Larimichthys crocea[5]等魚類中應用，開發了分子標記指導的家系選育、群體選育、遺傳結構優化等一系列切實可行的分子育種技術路線[6]，取得了良好的選育效果[7,8]。既利用表型數據又利用基因型數據的分子育種技術是育種的換代技術，具有巨大的應用潛力與優勢。

混合家系選育及群體選育是魚類育種中常用的技術，但是，其繁殖的子代系譜不清，連續幾代繁殖后近親衰退嚴重。基于親本遺傳背景的分子育種技術雖然可以解決這一難題，但是，有2 個因素制約了其推廣應用：一是用分子標記區分大量家系混合群體的工作量巨大，很難準確鑒別數百個家系。目前，用分子標記區分的最大的家系數目是245個[9]，限制了育種的強度；二是在苗種價值較低的魚類中應用此法投入巨大，不利于在基層育種單位推廣。本研究將家系選育的準確性和群體選育的易操作性相結合，建立了標記指導的大規模混合家系選育技術，利用“優選法”理念，不以鑒別和區分家系為目的，而是利用表型選擇獲得優良的核心群體后，用分子標記鑒定選擇的個體的系譜關系。以鏡鯉的選育為例，具體介紹了該技術的操作流程和簡要技術路線（圖1）。該技術方案避免了近親交配，簡化了育種步驟，減輕了工作量，提高分子育種技術的可操作性，可適應不同生產條件的分子育種工作。

1 材料與方法

1.1 材料

鏡鯉親本繁育群體為分子標記指導家系選育的F1代[2]，來自黑龍江水產研究所呼蘭實驗站。親本的選擇包括外觀選擇、表型數據選擇、分子標記選擇，具體選擇標準及詳細實驗步驟參照文獻[6]。選擇3+齡親本334 尾，雌魚210 尾，雄魚124 尾，平均體質量2 314.44g，平均體長39.71cm。電子標記后，按參考文獻[2]方法取鰭條，提取基因組DNA。

根據親本個體間的遺傳差異，以繁殖組內任何一對雌、雄魚間無近親交配關系為原則設計家系配組，建立大規模組間混合家系繁殖子代。繁育的部分苗種依托天津市天祥水產有限責任公司養殖和選育，經過2 個年度的系統培育和選育，形成了F2代繁殖的核心群體300 尾，電子標記后，采集鰭條樣本，提取基因組DNA。

1.2 引物與試劑

選取20 個與體長、體質量、體高、飼料轉化率等[10-13]生長性狀相關的QTL 標記檢測了F1和F2親本個體間的遺傳差異。引物由上海生工生物工程公司（簡稱上海生工）合成，引物信息見表1。實驗所用的Taq DNA 聚合酶、dNTP 及生化試劑均購自上海生工。

1.3 PCR 擴增及檢測

15μL PCR反應體系含10 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0），50 mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2，dNTP 各200 μmol/L，微衛星上下游引物各5 pmol，Taq DNA聚合酶1U，DNA 模板100 ng。反應程序為：94℃預變性3 min；94℃變性30s，51～60℃復性30 s，72℃延伸30 s，27 個循環；最后72℃下延伸5min。擴增產物用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，用Gel-Pro Analyzer 4.5 軟件分析電泳條帶的大小。

1.4 數據處理

微衛星是共顯性遺傳，可從凝膠電泳圖譜上直接判斷出個體的基因型，用自主開發的“魚類種質資源遺傳分析平臺（專利號：ZL200710144749.3）”處理個體間遺傳數據，將其轉化為PHYLIP 3.6 識別數據格式，用PHYLIP 3.6 軟件的gendist 程序計算個體間的遺傳距離，用neighbor 程序繪制聚類圖，經過1 000 次抽樣自舉檢驗，選定唯一聚類圖，用自主開發的計算機軟件“基于遺傳背景的分子育種軟件1.0（登錄號：2011SR091052）”劃分繁殖系譜，組間雌雄個體交叉進行配組繁殖混合家系，以避免近親繁殖。

圖1 標記指導大規模混合家系選育技術路線簡圖Fig.1 Technical route diagram of large-scale mixed family selection assisted by microsatellite markers

表1 本研究用的微衛星引物及其序列Tab.1 Sequences of microsatellite primers used in the experiment

2 結果與分析

2.1 鏡鯉F1親本個體間的遺傳差異

用20 個微衛星標記分析了鏡鯉親本個體間的遺傳差異，用PHYLIP 3.6 軟件包內的gendist 程序計算了個體間的遺傳距離在0.0120～2.0794 之間。neighbor 程序繪制的聚類結果顯示，多數親本個體具有相似的遺傳背景，個體間遺傳分化程度較小。其中328 個個體在相同節點處聚成74 個分支，多數個體以2～5 個個體聚為一支，占全部分支的79.73%，其中43.28%的個體遺傳距離處于0.4～0.7的范圍之內（圖2），適合作為親本繁殖下一代，而存在近親交配風險的個體數僅占7.90%。

以分支間雌雄個體交叉進行群體繁殖，控制每對親本配組的遺傳距離位于0.4～0.7 之間，建立大規模混合家系。當年累計建立了約500 個混合家系，獲得F2苗種約100 萬尾，其中約30 萬尾由天津市天祥水產有限責任公司養殖及選育，作為下一代繁殖用的后備親魚。

2.2 子代混合家系的培育及選育

圖2 F1親本個體間遺傳距離范圍分布圖Fig.2 Distribution diagram of genetic distance range among F1parental individuals

約30 萬尾超大混合家系F2代魚苗運往天津市天祥水產有限公司養殖和培育，當年10 月（1-齡魚種）和次年10 月（2-齡成魚）選優去劣，由經驗豐富的養殖技術人員選擇留取體型優良、生長優勢明顯、鱗被規范的個體，最終獲得F2代的2 齡備選親魚300 尾,雌性200 尾，雄性100 尾，平均體質量（1 564.93±335.05）g，平均體長（35.85±3.10）cm，累計留種比例為1 000∶1。各階段選育的群體體質量性狀及留種情況見表2。

2.3 優良個體的系譜分析

對選出的300 尾后備親本進行電子標記，采集鰭條樣本，用20 個與生長性狀相關的微衛星標記分析基因型，利用“基于遺傳背景的分子育種軟件1.0”將其中的288 尾個體劃分到20 個繁殖系譜，每個繁殖系譜含有9～21 個個體，平均體質量（1 441.67±99.35）～（1 783.57±150.14）g，平均體長（34.37±0.59）～（37.32±1.08）cm，其中15 個繁殖系譜的平均體質量達到了預定規格（1 500 g）以上，占75%（圖3）。

表2 F2代大規模混合家系養殖及選育過程Tab.2 The rearing and breeding process of large-scale mixed family of F2generation in mirror carp

圖3 20 個繁殖系譜體質量性狀比較Fig.3 Comparative analysis of body weight among twenty breeding pedigrees

3 討論

電子標記輔助的大規模家系選育技術已經成功用于挪威大西洋鮭Salmo salar 和美國優質虹鱒Oncorhynchus mykiss 的選育[14]，但是，其構建上百個家系，先分池飼養，然后電子標記混合飼養的技術路線并不適用于我國，尤其不適用于產卵量大、苗種價格低、投入低的鯉科魚類的苗種生產及培育。本研究結合了大規模家系選育的優點，利用分子標記揭示的親本個體間的遺傳差異輔助構建混合家系，在苗種階段即同池混合飼養，通過多次的表型選擇[6]，保留生長及體型優良的個體，形成后備親魚；再次使用分子標記鑒定優良個體的繁殖系譜，下一代繁殖時，以繁殖系譜間親魚配組，最大限度地避免了近親繁殖又簡化了操作步驟，獲得了最大的選擇強度和選擇效果。

開展魚類家系選育的關鍵是選擇配組親本，難點是大規模家系的混合群體中鑒定出優良家系或確定繁殖系譜。利用分子標記揭示的親本間遺傳差異指導家系配組在作物[15,16]及畜禽[17]中已廣泛應用。在水產動物中，魯翠云等[2]用微衛星標記指導鏡鯉家系親本的配組，顯示親本間遺傳距離在0.5～0.7之間的子一代具有較好的生產性能。畢金貞等[3]研究發現，牙鲆親本間遺傳距離在0.2578～0.5958 范圍內，與后代生長速度之間呈顯著正相關（P＜0.05）。常玉梅等[5]用遺傳差異指導群體繁殖的大黃魚的生產性能和抗逆性比對照組有較大提高。孫效文等[6]通過連續多年的實驗，提出鏡鯉雌雄親本配組親緣關系的閾值是“遺傳距離小于0.2、大于0.7 的1 對雌雄個體不適合繁殖配組，最佳配組雌雄個體的遺傳距離范圍為0.5～0.7。而利用微衛星標記鑒定混合養殖家系的系譜關系也已在中國明對蝦Fenneropenaeus chinensis[18]、大菱鲆Scophthalmus maximus[19]、馬氏珠母貝Pinctada martensii[20]等水產動物育種中應用。本研究將微衛星標記與大規模混合家系選育技術相結合，利用微衛星標記揭示的親本間遺傳差異指導建立大規模混合家系，將大多數親本個體聚為74 個組，其中43.28%的個體間遺傳距離處于0.4～0.7 的范圍之內，適合用于家系的繁殖配組，組間雌雄交叉繁殖混合家系約500 個，達到了大規模家系選育的程度。經過2 整年的表型選擇，獲得了第二代后備親魚，選擇強度達到了1‰，再次用微衛星標記結合配組軟件將后備親魚中的大部分優良個體劃歸20 個繁殖系譜，為下一代的繁殖配組奠定了基礎。

近年來，我國多數主要養殖魚類相繼開發了大量的共顯性標記，具備了開展基于遺傳背景的分子育種研究的條件，開展分子育種將是水產養殖動物育種研究的一種趨勢和方向，多家系混合選育可以消除環境差異的影響，也將是分子育種的重要技術程序。但如果從幾百個家系的混合群體中將所有家系區分開來將是一個成本高、工作量巨大的檢測工作，如本研究使用500 個家系，要區分這些家系，每個家系用30 個個體就要15 000 個個體，用20 個標記鑒定也要獲得30 萬個基因數據，其分析工作量非常巨大，檢測成本也將達到上百萬元。本研究介紹的標記指導的大規模混合家系選育技術，借鑒“優選法”理念，不以鑒別和區分所有家系為目標，放棄了對所有實驗家系進行系譜分析或親權鑒定，而是在1 齡和2 齡各利用表型選留一次后備親本，僅深入分析目標性狀優秀的個體，例如開展繁殖系譜劃分、親權關系鑒定、全基因組重測序等，減少了基因型分析的工作量，既節省了成本，也達到了利用分子標記輔助建立優良后備親魚群體的目標，是一個選擇強度大的實用分子育種技術方案。