顯微介導河蟹基因的鏡鯉F1代肌肉營養成分分析

閆學春，欒培賢，何立川

（中國水產科學研究院黑龍江水產研究所，淡水魚類育種國家地方聯合工程實驗室，淡水水產生物技術與遺傳育種重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150070）

中華絨螯蟹Eriocheir sinensis（也稱河蟹）是我國特有的大型淡水蟹類，自然分布較廣，肉質細嫩，味道鮮美，含有豐富維生素和礦物質，蛋白質的含量要高于魚肉和豬肉的幾倍，具有優良的遺傳資源[1，2]。德國鏡鯉Cyprinus carpio L.是我國主要的淡水養殖魚類，應用外源總DNA 直接導入法，將河蟹的這些有益的特定營養成分導入鏡鯉，對加速優質鏡鯉品種的選育，培育出適合消費需求的多樣化優質鏡鯉養殖新品種具有重要意義[3]。對顯微介導河蟹總DNA 導入鏡鯉的檢測與分析已有報道[2]。顯微介導遠緣雜交技術可以進行常規育種方法難以完成的品種間，甚至更遠的品種間的雜交，實現目的基因轉移。

近年來，隨著人們生活水平的不斷提高，對淡水鯉科魚類肉質的要求也在提高。提高低質淡水鯉科魚類品質是我國水產育種工作重要任務。而肌肉營養組成是評定魚類經濟價值的重要指標和了解其肉質的最直接方法。利用外源總DNA 導入技術來提高動植物及其子代的氨基酸和蛋白等含量的研究已有過報道。如徐德昌等將大豆Glycine max（Linn.）Merr.基因組DNA 導入春小麥Triticum aestivum L.，獲得了蛋白含量高2 個百分點，清蛋白、球蛋白含量也明顯提高的一批可遺傳的變異株[4]；毛萬霞等利用花粉管通道法和兩種不同壓力基因槍法將大豆總DNA 導入大麥Hordeum vulgare L.，大麥后代籽粒的蛋白質和必需氨基酸含量都有提高[5]；呂英海等采用基因槍法和花粉管通道法將大豆總DNA 直接導入大麥，提高了籽粒總氨基酸和各種必需氨基酸含量[6]；閆學春等利用顯微介導遠緣雜交技術，將中國明對蝦Fenneropenaeus chinensis 總DNA 導入鯉受精卵內，提高了顯微介導中國明對蝦基因的鯉及其子代的蛋白質和氨基酸含量[7,8]。本文通過分析顯微介導河蟹基因的鏡鯉與普通鏡鯉肌肉的營養成分，研究和比較這兩種鏡鯉的營養價值，發現顯微介導河蟹基因鏡鯉的蛋白和氨基酸含量高于普通鏡鯉，為超遠緣分子雜交和創制鏡鯉新種質技術提供了新方法和新途徑。

1 材料和方法

1.1 材料

顯微介導河蟹基因的鏡鯉取自本課題組生產的1 齡顯微介導河蟹基因鏡鯉F1代（以下簡稱實驗魚）和普通鏡鯉（以下簡稱對照魚），各隨機取30尾，平均體質量分別為234g 和227g。2 種魚的生長環境、飼養管理、飼料投喂等均相同。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理

肌肉樣品采用冷鮮樣品。取實驗魚與對照魚背部肌肉，去皮，將魚肉切成小塊、搗碎，用于測定蛋白質和氨基酸含量。

1.2.2 常規營養成分測定

粗蛋白和氨基酸含量由農業部谷物及制品質量監督檢驗測試中心（哈爾濱）測定。粗蛋白質測定采用凱氏微量定氮法（國家標準：GB 5009.5-2010）；17 種氨基酸含量用鹽酸水解法（國家標準：GB/T 5009.124-2003），經日立L-8800 型氨基酸自動分析儀測定。色氨酸在水解過程中被破壞沒有測定。

1.3 營養評價

實驗魚的營養價值評價依據FAO/WHO 1973年建議的每克氮氨基酸評分標準模式和雞蛋蛋白模式進行比較。氨基酸評分（Amino Acid Score,AAS）、化學評分（Chemical Score,CS）和必需氨基酸指數（Essential Amino Acid Index,EAAI）分別按下式計算[9-12]。

式中，n 代表比較的氨基酸數；tn代表實驗蛋白質的氨基酸；sn代表雞蛋蛋白質的氨基酸。

1.4 數據處理

結果以平均值±標準差（x±s）表示，采用SPSS軟件進行統計分析，用t 檢驗法分析差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 一般營養成分

經測定，顯微介導河蟹基因的鏡鯉肌肉中粗蛋白質含量為20.71%，比普通鏡鯉（18.32%）高13.05%，數理統計分析表明，沒有顯著差異（P＞0.061）（圖1）。

圖1 顯微介導河蟹基因的鏡鯉F1代與普通鏡鯉的蛋白質含量Fig.1 The contents of protein in F1generation of mirror carp with micro-injection Chinese mitten handed crab and common mirror carp

2.2 氨基酸組成

由表1 可知，顯微介導河蟹基因的鏡鯉與普通鏡鯉均含有17 種氨基酸，含量分別為78.94%和67.89%。兩種魚的谷氨酸、天門冬氨酸、甘氨酸和丙氨酸4 種鮮味氨基酸總量[13,14]分別為30.12%和25.86%，顯微介導河蟹基因的鏡鯉總氨基酸含量和4 種鮮味氨基酸含量均高于普通鏡鯉。

圖2 F1代顯微介導河蟹基因鏡鯉的鮮味氨基酸含量Fig.2 The content of flavor amino acids in F1mirror carp generation with micro-injection Chinese mitten handed crab gene

由表2 可知，顯微介導河蟹基因的鏡鯉與普通鏡鯉中均含有7 種人體必需氨基酸（蘇氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸和賴氨酸），其含量分別占氨基酸總量的40.82%和41.02%，顯微介導河蟹基因的鏡鯉必需氨基酸總含量比普通鏡鯉高15.69%。

2.3 氨基酸營養評價

表2 和表3 是分別將顯微介導河蟹基因的鏡鯉和普通鏡鯉肌肉蛋白中氨基酸含量換算成每克氮中含氨基酸毫克數，再與蛋白質評價的氨基酸標準模式和雞蛋蛋白質的氨基酸模式進行比較，計算出兩種魚的氨基酸評分（AAS）、化學評分（CS）和必需氨基酸指數（EAAI）。

3 討論

3.1 顯微介導河蟹基因的鏡鯉和普通鏡鯉肌肉常規營養成分比較

蛋白質含量是魚類營養價值的體現，是評價和建立魚類種質標準的重要指標之一[15-19]。而導入單個基因對魚類蛋白的影響已在唐魚Tanichthys albonubes 和鯉進行研究。如樊佳佳和白俊杰在分析含有外源基因的轉紅色熒光蛋白基因唐魚的肌肉營養成分時，發現轉基因唐魚的粗蛋白質含量高于非轉基因唐魚，但差異不顯著（P＞0.05）[20]；閆學春等[21]發現，轉大麻哈魚Oncorhynchus keta 生長激素基因的鯉肌肉中蛋白質含量稍高于非轉基因鯉，但無顯著差別（P＞0.05）；崔宗斌等[22]發現，轉人Homo sapiens 生長激素基因F2代陽性紅鯉的蛋白質含量顯著高于對照魚。在本研究中，顯微介導河蟹基因的鏡鯉肌肉中粗蛋白質含量為20.71%，比普通鏡鯉（18.32%）高13.05%，其原因可能是導入的外源基因是控制蟹類蛋白質合成的某段基因，激活了鏡鯉的一些相關基因，導致顯微介導河蟹基因的鏡鯉蛋白質含量增高。至于是導入經過遺傳修飾的單個基因，還是未經遺傳修飾的外源總DNA 的導入會影響魚體內蛋白質合成與分解的代謝機制，還有待進一步深入研究。目前，已報道，有多個信號通路參與了蛋白質的合成與分解代謝過程。如泛素-蛋白酶體通路（ubiquitin-proteasome pathway,UPP）是調節細胞內蛋白水平與功能的重要機制，是細胞內蛋白質降解的主要途徑，參與細胞內絕大多數蛋白質的降解[23-25]；而雷帕霉素靶蛋白（Target of Rapamycin,TOR）信號通路是控制蛋白質合成的主要通路，TOR調控整體的翻譯水平，促進細胞生長[26-28]。從本研究結果看，可能是導入的河蟹基因直接參與了這些信號通路，也有可能是間接調控這些通路中的關鍵酶，從而影響了顯微介導河蟹基因的鏡鯉的蛋白質組成，進而促進了蛋白質含量的提高，當然，影響顯微介導河蟹基因的鏡鯉更為精細和復雜的代謝變化，值得繼續深入研究。

表1 顯微介導河蟹基因的鏡鯉F1代與普通鏡鯉的肌肉中氨基酸含量（g/100g DW）Tab.1 The contents（g/100g DW）of amino acids in muscle of mirror carp F1generation with micro-injection Chinese mitten handed crab gene and common mirror carp

表2 F1代顯微介導河蟹基因的鏡鯉與普通鏡鯉肌肉必需氨基酸含量Tab.2 The contents of essential amino acids in muscles of F1generation of mirror carp with micro-injection Chinese mitten handed crab gene and common carp

表3 F1代顯微介導河蟹基因鏡鯉與普通鏡鯉的氨基酸評分、化學評分和必需氨基酸指數比較Tab.3 Comparison of amino acid score,chemical score and essential amino acid index in mirror carp with microinjection Chinese mitten handed crab gene and common carp

3.2 顯微介導河蟹基因的鏡鯉氨基酸含量分析和營養價值評定

分析結果表明，顯微介導河蟹基因的鏡鯉與普通鏡鯉均含有17 種氨基酸（色氨酸除外），第一限制氨基酸都是纈氨酸，不同的是：顯微介導河蟹基因鏡鯉的第二限制氨基酸是蘇氨酸，而普通鏡鯉是蛋氨酸和胱氨酸。這與顯微介導中國對蝦基因的鯉的研究結果一致[7，8]。而第一限制氨基酸纈氨酸在顯微介導河蟹基因的鏡鯉中含量要高于普通鏡鯉，且差異顯著，可以在蛋白質營養上起到補缺作用。顯微介導河蟹基因鏡鯉的必需氨基酸占總氨基酸的40.82%，高于WHO/FAO 模式，低于雞蛋蛋白模式，而普通鏡鯉都低于這兩種模式。顯微介導河蟹基因的鏡鯉與普通鏡鯉肌肉的必需氨基酸指數分別為72.92 和62.68，其營養價值高于普通鯉。由表1 可知，天門冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸和丙氨酸這4 種鮮味氨基酸在顯微介導河蟹基因的鏡鯉肌肉中含量較高，達30.12%，比普通鏡鯉（25.86%）高，其中甘氨酸和丙氨酸差異顯著，其味道要比普通鏡鯉更鮮美。4 種鮮味氨基酸含量隨導入河蟹總DNA 的顯微介導河蟹基因鏡鯉總氨基酸含量的提高而升高，而其他必需氨基酸也會明顯提高，如蘇氨酸、纈氨酸，與普通鏡鯉比較，差異顯著。這表明利用顯微介導遠緣雜交技術導入河蟹總DNA 還能夠全面提高鏡鯉的蛋白質質量，這對鏡鯉的品質改良具有重要意義。

綜上所述，顯微介導河蟹基因的鏡鯉與普通鏡鯉肌肉營養成分的構成種類一致，但是，含量上差異很大，特別是氨基酸含量。顯微介導河蟹基因的鏡鯉肌肉營養成分高于普通鏡鯉，暗示了河蟹基因對顯微介導河蟹基因鏡鯉的蛋白質合成與分解代謝產生了不可忽略的影響。通過顯微介導遠緣雜交技術導入外源總DNA，可以進行常規育種難以做到的種間雜交，實現優良性狀基因的轉移，彌補了優異基因資源的缺乏，特別是與魚肌肉品質相關的基因，本技術為解決在遠緣甚至超遠緣物種間多基因復雜性狀的轉移提供了很好的思路和方法。