食管鱗狀細胞癌患者microRNA-127-3p的表達水平及臨床意義

符佳，汪砥，江金瓊，劉勁，段華新

（1.湖南省人民醫院 腫瘤科，湖南 長沙 410005；2.長沙市中心醫院 腫瘤科，湖南 長沙 410004）

我國食管鱗狀細胞癌（esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）發病率較高，嚴重威脅患者生命健康[1-2]。其發病機制復雜，與諸多分子機制有關[3-5]。明確其發生、發展的分子機制，有利于ESCC早期診斷與靶向治療[6]。有研究表明，microRNA（miRNA）與胚胎發育、器官形成及腫瘤形成關系密切，其中miR-127-3p與乳腺癌、宮頸癌等腫瘤形成密切相關[7]。有研究表明SKI基因是miR-127-3p潛在的靶基因，但在ESCC中鮮有報道[8]。因此，本研究探討ESCC患者癌組織中miR-127-3p及SKI蛋白表達水平與腫瘤分期、患者預后的關系，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2013年2月—2015年2月于湖南省人民醫院和長沙市中心醫院行外科手術的ESCC患者80例。其中，男性52例，女性28例；平均年齡（57.1±7.6）歲。患者均未合并影響生存的重大疾病，術中取適量切除的癌組織及癌旁組織（距癌組織≥5 cm正常食管上皮組織），放置于液氮中保存。ESCC診斷最終經病理證實且分化程度明確。參照2009年第7版國際抗癌聯盟TNM分期標準[9]，其中Ⅰ期患者22例，Ⅱ期患者31例，Ⅲ期27例；淋巴結轉移21例，無淋巴結轉移59例。本研究經醫院倫理委員會批準，受試者均自愿簽署知情同意書，并對患者隨訪至2018年2月。

1.2 試劑與儀器

DMEM培養液（美國Gibco公司），0.25%胰酶（美國Invitrogen公司），ALP活性檢測試劑盒（南京建成生物工程有限公司），二氧化碳CO2細胞培養箱（德國HeraeusHolding公司），Olympus倒置顯微系統（TH4-200，南京天龍光電儀器廠），實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）儀（LightCycler480，德國羅氏診斷有限公司），TaqMan? MicroRNA Reverse Transcription Kit試劑盒（美國應用生物系統公司）。

1.3 細胞復蘇及培養

本研究中使用的ESCC細胞株Eca109、Kyse150及正常食管上皮細胞Het-1a均購自中國科學院上海細胞庫。由液氮罐中迅速取出凍存的細胞，37℃水浴鍋解凍，接種于一次性細胞培養瓶（25 cm2）中，加入 5 ml DMEM 培養液，放入 37℃培養箱在 5% CO2條件下培養，換液頻率為2 d/次。當貼壁細胞匯合度達到約90%時，用0.25%胰酶消化傳代，計數細胞后按1×105個/ml濃度接種繼續培養，將傳至第3～5代的細胞進行誘導分化實驗。

1.4 RNA 提取

1.4.1 組織中提取由液氮中取出食管癌患者組織，加入研缽中，迅速磨成粉末狀；取出100 mg新鮮研磨的粉末加入含1 ml Trizol裂解液的EP管中，混合均勻。室溫靜止5 min，加入200μl氯仿，充分混勻后室溫放置 10 min ；4℃、3 500 r/min 離心 15 min，取上層水相，裝于含1.5 ml RNase-free水的離心管中，加入等體積異丙醇，混勻，置于冰上30 min；取出離心管，4℃、3 500r/min 離心 15 min，得到 RNA 沉淀 ；75% 酒精500μl洗滌RNA，沉淀2次，風干；加入RNase-free的水50μl，室溫溶解RNA；NanoDrop測定RNA濃度，置于-20℃條件下備用。

1.4.2 細胞中提取對各組細胞予以 0.25% 胰酶消化，將消化后的細胞懸液置于15 ml離心管中；在4℃、500 r/min低速離心2 min，棄上清，放置冰上；滴入1 ml Trizol裂解液重懸，混勻細胞，放置冰上；向Trizol裂解液中加入200μl氯仿，劇烈震蕩細胞懸液，室溫放置 5～10 min，在 4℃、3 500 r/min 離心 15 min ；取上層水相，裝入含 1.5 ml RNase-free水的離心管中，放入等體積異丙醇，混勻后，放置冰上30～35 min ；在 4℃、3 500 r/min 離心 15 min，獲取RNA沉淀；75%酒精500μl洗滌RNA沉淀2次，風干；放入50μl RNase-free水，室溫溶解RNA；NanoDrop測定RNA濃度，置于-20℃條件下備用。

1.5 qRT-PCR

參考 TaqMan? MicroRNA Reverse Transcription Kit試劑盒說明書進行操作，對抽提的RNA進行體外逆轉錄實驗，得到cDNA產物。反應條件：16℃孵育 30 min，42℃孵育 30 min，85℃加熱 5 min，4℃保存。以得到的cDNA為模版，予以qRT-PCR，采用 TaqMan? Universal PCR Master Mix 20 μl反 應 體系，在PCR儀上操作，以U6作為表達檢測的內參，ΔCT表示miR-127-3p的相對表達，其中ΔCT=CTU6-CTmiR-127-3p，反應條件 ：95℃預變性 10 min，95 變性15 s，60℃退火 30 s，70℃延伸 30 s，共40個循環。見表1。

1.6 免疫組織化學染色檢測 SKI蛋白

對石蠟切片進行2次脫蠟過程，對脫蠟后的組織進行酒精梯度清洗：二甲苯孵育5 min，棄去二甲苯，加入新的二甲苯繼續孵育5 min，無水乙醇洗滌3 min，無水乙醇Ⅱ洗滌3 min，95%乙醇洗滌3 min，80%乙醇洗滌 3 min，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline,PBS）洗滌 3次，3 min/次 ；將切片至于含0.01 mmol/L的檸檬酸緩沖液中，對切片進行恢復，并放入微波爐，加熱15 min，冷卻至室溫；取出石蠟切片，置于含3%雙氧水中10～15 min，以防止內源性過氧化物酶對切片組織的損傷，用1×PBS緩沖液沖洗3次，3 min/次；按照1∶500加入SKI抗體，對石蠟組織切片進行室溫孵育1 h或者4℃孵育過夜，用1×PBS緩沖液沖洗3次，3 min/次；按照1∶1 000加入辣根過氧化物酶標記的二抗，對石蠟組織切片進行室溫孵育40 min，用1×PBS緩沖液沖洗3次，3 min/次；加入DAB試劑盒中的顯色劑，室溫孵育5～10 min，然后清水沖洗；蘇木精復染室溫孵育3～5 min，清水沖洗；對染色后的切片進行梯度酒精水化處理，然后樹膠封片觀察。采用上述同樣的操作方法，對組織切片中的SKI進行免疫組織化學染色。同時以1×PBS緩沖液為一抗進行孵育，作為免疫組織化學染色的陰性對照。對每張切片隨機選取5個高倍鏡視野（400倍），計算SKI蛋白陽性細胞所占總細胞數目的比例，陽性表達的細胞數目＞10%為陽性，＜10%為陰性。

1.7 統計學方法

數據分析采用SPSS 21.0統計軟件。計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用t檢驗或方差分析；計數資料以率（%）表示，比較用χ2檢驗；Kaplan-Meier法繪制生存曲線，比較用Log-rank χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各細胞系中 miR-127-3p 相對表達量比較

Het-1a細胞中miR-127-3p相對表達量為（3.04±0.78），Eca109 為（2.38±0.53），Kyse150 為（1.42±0.51），經方差分析，差異有統計學意義（F=5.506，P=0.000）；Het-1a高 于 Kyse150（P＜0.05），Eca109高于 Kyse150（P＜0.05）。見圖1。

圖1 各細胞系中 miR-127-3p 相對表達量比較（±s）

2.2 食管鱗癌與癌旁組織miR-127-3p相對表達量比較

食管鱗癌組織中miR-127-3p相對表達量為（0.86±0.23），癌旁組織為（1.84±0.35），經t檢驗，差異有統計學意義（t=11.547，P=0.000），癌組織高于癌旁組織。見圖2。

圖2 食管鱗癌與癌旁組織miR-127-3p相對表達量比較（±s）

2.3 食管鱗癌與癌旁組織 SKI蛋白表達的比較

患者癌組織及癌旁組織中SKI蛋白主要表達于細胞質。食管鱗癌中SKI蛋白表達陽性率為78.75%，陰性率為21.25%，癌旁組織中陽性率為13.75%，陰性率為86.25%，經χ2檢驗，差異有統計學意義（χ2=67.982，P=0.000），癌組織高于癌旁組織。見圖3。

圖3 SKI蛋白光鏡圖（免疫組織化學×400）

2.4 不同臨床指標患者的miR-127-3p低表達率比較

不同臨床分期患者miR-127-3p低表達率比較，差異有統計學意義（P＜0.05），Ⅲ期高于Ⅱ期和I期。是否有淋巴結轉移和飲酒史患者miR-127-3p低表達率比較，差異有統計學意義（P＜0.05），有淋巴結轉移和飲酒史患者較高。見表2。

表2 不同臨床指標患者的 miR-127-3p 低表達率比較 %

2.5 食管鱗癌患者 miR-127-3p 的表達與預后

42例食管鱗癌患者癌組織miR-127-3p低表達，38例患者高表達。20個月時miR-127-3p低表達患者生存率為47.6%，高表達患者為73.7%，經Log-rank χ2檢驗，差異有統計學意義（χ2=4.946，P=0.026）。miR-127-3p低表達患者中位無進展期（20個月）短于miR-127-3p高表達患者（30個月）。見圖4。

圖4 癌組織中miR-127-3p表達水平與食管鱗癌患者預后的關系

3 討論

我國食管癌發病例數占全球一半以上，為食管癌高發國家，目前miRNA與食管癌關系的研究日益深入[10]。miRNA在食管癌中的表達存在差異，并且能調節食管癌的增殖、凋亡、侵襲及遷移等生物學特性，這些證據表明miRNA參與食管癌發生、發展等病理過程[11-12]。對miRNA與食管癌關系的研究，目前主要集中在 miR-21、miR-203、miR-375、miR-106b-25、miR-143及miR-196a等的異常表達[13]。王江峰等[14]研究結果提示在84例食管鱗癌組織中，相比于癌旁組織，癌組織中miR-29b低表達48例，正常表達28例，而高表達只有8例；進一步分析發現癌組織中miR-29b低表達的患者，其腫瘤浸潤程度低，TMN分期早，預后效果較好；羅君等[15]在食管鱗癌患者組織中檢測miR-31的表達發現，其相比正常組織中表達上調，推測其表達上調可能會促進鱗癌發生、發展過程。KURASHIGE等[16]對患者血漿中的miR-21進行檢測發現，食管鱗癌患者術后血漿miR-21明顯表達下調，暗示其可能與食管癌患者預后相關。趙鑫等[17]通過對在大鼠星形膠質細胞的研究發現，加入脂多糖對大鼠進行誘導，可上調細胞中SKI蛋白的表達，表明其可能參與炎癥的發生；JIANG等[18]通過第二代測序技術對miRNAs進行測序，發現miR-127-3p在膠質瘤細胞中表達下調，其表達水平的下調是由于DNA甲基化與組蛋白乙酰化的作用，從而導致基因的轉錄表達被抑制；對其進一步研究發現，miR-127-3p可通過靶向調控SKI蛋白，激活TGF-β信號的傳導過程，抑制膠質瘤細胞的增殖，但對食管鱗癌的研究鮮有報道。

本研究對80例ESCC患者進行miR-127-3p的表達檢測,結果癌組織中存在低表達；進一步通過細胞學培養實驗發現，miR-127-3p在食管鱗癌細胞中低表達，且在臨床分期Ⅰ期中表達最低；分析患者的臨床特征與miR-127-3p在癌組織中的表達關系發現，miR-127-3p的表達水平與患者性別、年齡以及吸煙史無關，而與患者食管鱗癌的分期、有無轉移及飲酒史相關。表明食管鱗癌組織中miR-127-3p的表達與食管癌的發生有關，其表達上調與食管鱗癌的發展、轉移相關，暗示其在食管鱗癌的發生、發展過程中起重要作用；筆者同時對80例患者進行了隨訪觀察，其中42例患者食管鱗癌組織中的miR-127-3p存在低表達，而38例患者食管鱗癌組織中的miR-127-3p相比于癌旁組織變化無差異；繪制生存曲線進行分析發現，高表達miR-127-3p患者中位無進展期長于miR-127-3p低表達患者。

綜上所述，在ESCC患者中，相比癌旁組織，癌組織中miR-127-3p存在低水平表達。進一步體外細胞實驗驗證，miR-127-3p在食管鱗癌細胞中存在低表達，并且與食管癌的發生、發展及預后密切相關。