USP33在結直腸癌組織中的表達及與Wnt/β-catenin通路的關系

（義烏市中心醫院 肛腸外科，浙江 義烏322000）

結直腸癌的預后與分期關系密切，出現轉移的結直腸癌患者5年生存率較低，嚴重影響患者健康[1-2]。泛素特異性蛋白酶33（USP33）為泛素特異性蛋白酶家族成員之一，在多種惡性腫瘤中表達異常。其在惡性腫瘤的侵襲、遷移中發揮重要作用[3]，可通過多種信號通路參與惡性腫瘤的侵襲、遷移過程[4]。Wnt/β-catenin信號通路在結直腸癌的發生、發展中具有重要作用，抑制Wnt/β-catenin信號通路對結直腸癌具有抗癌作用[5-6]。本文對結直腸癌組織中USP33的表達及與Wnt/β-catenin通路的關系進行研究。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年1月—2017年12月義烏市中心醫院肛腸外科結直腸癌組織標本及對應的癌旁組織標本各90例。其中，男性55例，女性35例；平均年齡（61.25±4.56）歲；腫瘤直徑（2.37±1.34）cm；分化程度：低分化36例，中分化25例，高分化29例；Dukes分期：A期24例，B期23例，C期27例，D1期 16例 ；浸潤深度 ：≥T243例，＜T247例；有淋巴結轉移40例，無淋巴結轉移50例；肝轉移42例，無肝轉移48例。納入標準：所有患者行首次手術治療；經病理證實為結直腸癌。排除標準：術前行放化療等其他治療。本研究通過本院倫理委員會批準，患者簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 試劑兔抗人 USP33 多克隆抗體、鼠抗人USP33多克隆抗體、鼠抗人β-catenin多克隆抗體及鼠抗人C-myc多克隆抗體等購自美國Abcam公司，ECL購自美國Sigma公司。

1.2.2 免疫組織化學染色將結直腸癌組織和癌旁組織石蠟切片脫蠟至水，置微波爐加熱5 min修復抗原，用10%山羊血清封閉15 min，加入USP33、β-catenin及C-myc一抗（1∶400）過夜孵育。加入生物素標記二抗孵育1 h；加入辣根酶標記鏈霉卵白素孵育15 min，DAB顯色，蘇木精-伊紅染色，鹽酸酒精返藍，梯度酒精脫水；經透明、封片后拍照觀察。結果判斷：根據切片陽性細胞著色強度和陽性細胞比例判斷，細胞質出現棕褐色顆粒為陽性，選擇5個400高倍視野觀察，細胞著色強度評分。無著色：0分；淺黃色：1分；棕黃色：2分；棕褐色：3分。陽性細胞比例評分，陽性細胞比例0%：0分；陽性細胞比例≤10%：1分；陽性細胞比例＞10%～50%：2分；陽性細胞比例＞50%～70%：3分；陽性細胞比例＞70%：4分。細胞著色強度和陽性細胞比例評分乘積≥5分為陽性，＜5分為陰性。

1.2.3 Westernblotting 取結直腸癌組織和癌旁組織標本勻漿，用蛋白裂解液提取總蛋白，經電泳、轉膜，脫脂奶粉封閉 2 h，加入一抗 USP33（1 ∶ 1 000）、β-catenin（1∶250）及C-myc（1∶250）過夜孵育。以β-actin為內參照，加入二抗（1∶1 000）孵育45 min，ECL顯色，Image J圖像分析軟件對蛋白條帶灰度值進行分析。USP33、β-catenin及C-myc蛋白相對表達量以USP33、β-catenin及C-myc蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值表示。

1.3 統計學方法

數據分析采用SPSS 20.0統計軟件。計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用t檢驗；計數資料以率（%）表示，比較用χ2檢驗；相關性分析用Pearson法，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 結直腸癌組織與癌旁組織中USP33、β-catenin及C-myc的表達

USP33主要在細胞質中表達；β-catenin主要在細胞質和細胞核中表達；C-myc主要在細胞核中表達。結直腸癌組織中USP33陽性16例，β-catenin陽性61例，C-myc陽性57例。癌旁組織中USP33陽性58例，β-catenin陽性14例，C-myc陽性15例。結直腸癌組織與癌旁組織中USP33（17.78% VS 64.44%）、β-catenin（67.78% VS 15.56%）及 C-myc陽性率（63.33% VS 16.67%）比較，經χ2檢驗，差異有統計學意義（χ2=40.479、50.491和40.833，均P=0.000）；結直腸癌組織中USP33陽性率低于癌旁組織，而β-catenin、C-myc陽性率高于癌旁組織（P＜0.05）。見圖1。

2.2 結直腸癌組織中USP33表達與臨床病理特征的關系

Dukes分期中A、B期與C、D期，有淋巴結轉移與無淋巴結轉移，以及有肝轉移和無肝轉移患者USP33陽性率比較，經χ2檢驗，差異均有統計學意義（P＜0.05）；Dukes分期C、D期，有淋巴結轉移及有肝轉移結直腸癌組織中USP33陽性率低于A、B期，無淋巴結轉移及無肝轉移者。不同年齡、性別、腫瘤直徑、分化程度及浸潤深度結直腸癌組織中USP33陽性率比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

2.3 結直腸癌組織與癌旁組織中USP33、β-catenin及C-myc蛋白相對表達量比較

結直腸癌組織和癌旁組織中USP33、β-catenin及C-myc蛋白相對表達量比較，經t檢驗，差異有統計學意義（P＜0.05）；結直腸癌組織中USP33蛋白相對表達量低于癌旁組織，而β-catenin、C-myc蛋白相對表達量高于癌旁組織（P＜0.05）。見表2和圖2。

2.4 結直腸癌組織中USP33與β-catenin、C-myc蛋白的相關性

結直腸癌組織中USP33與β-catenin、C-myc蛋白呈負相關（r=-0.612 和-0.564，均P=0.000）。

圖1 結直腸癌組織和癌旁組織中USP33、β-catenin及C-myc蛋白的表達（免疫組織化學染色×400）

表1 不同因素結直腸癌組織中 USP33 表達陽性率比較 [n =90，例（%）]

表2 結直腸癌組織和癌旁組織中 USP33、β-catenin及 C-myc 蛋白相對表達量比較（n =90，±s）

表2 結直腸癌組織和癌旁組織中 USP33、β-catenin及 C-myc 蛋白相對表達量比較（n =90，±s）

組別 USP33 β-catenin C-myc結直腸癌組織 0.12±0.04 0.29±0.07 0.64±0.15癌旁組織 0.37±0.06 0.11±0.03 0.14±0.05 t值 32.890 22.422 30.000 P值 0.000 0.000 0.000

圖2 結直腸癌組織和癌旁組織中 USP33、β-catenin及C-myc蛋白的表達

3 討論

結直腸癌患者的治療方法是以手術為主、輔以放化療的綜合治療。治療后可在一定程度上提高患者生存時間，但結直腸癌總體預后仍較差。因此，延長患者生存時間、提高療效仍是目前迫切需要解決的問題[7]。結直腸癌的發生、發展是一個多基因變異、多因素及多階段的過程，和多個癌基因及抑癌基因引起的基因突變關系密切。研究證實，結直腸癌的發生、發展和細胞代謝、周期及信號轉導通路等生命活動的紊亂和失調關系密切，原癌基因激活和抑癌基因失活是惡性腫瘤發生的最重要的遺傳基礎[8-9]。探索惡性腫瘤基因變異和表達具有重要意義。

USPs家族屬于半胱氨酸蛋白酶家族成員，USPs家族成員繁多，多種USPs家族成員和惡性腫瘤的發生、發展關系密切。USP33是USPs家族成員，USP33可以與VHL抑癌蛋白相互作用，因此又成為VHL相關性去泛素化酶1[10]。USP33在惡性腫瘤的發生、發展中發揮關鍵性作用。JIA等[11]發現，USP33在甲狀腺癌組織中表達下調，與甲狀腺癌的淋巴結轉移關系密切，是甲狀腺癌預后的獨立生物標志物。低表達UPS33甲狀腺癌患者的復發風險升高，USP33可減弱甲狀腺癌細胞的增殖、侵襲及遷移能力。UPS33可能為甲狀腺癌潛在的治療靶點和新的生物標志物。LIU等[12]研究發現，UPS33在結直腸癌組織中低表達，低表達患者的復發風險高、總體預后差，為晚期結直腸癌的新型預后標志物。過表達UPS33可抑制結直腸癌細胞的增殖、侵襲及遷移。本研究對義烏市中心醫院結直腸癌組織中UPS33的表達進行研究發現，結直腸癌組織中UPS33表達下調，與結直腸癌的Dukes分期、淋巴結轉移及肝轉移有關。Dukes分期、淋巴結轉移及肝轉移可反映結直腸癌的病情嚴重程度。本研究結果表明，UPS33可能參與結直腸癌的發生、發展過程，與患者疾病嚴重程度有關。

UPS33可通過多種信號通路參與惡性腫瘤的發生、發展過程，如USP33通過抑制SLIT2/ROB01信號通路，抑制肺腺癌細胞的侵襲、轉移[13]；USP33通過介導Slit-Robo信號通路，抑制結腸直腸癌細胞的遷移[14]；Wnt/β-catenin信號通路在惡性腫瘤中常被激活，與惡性腫瘤侵襲、轉移關系密切[15]；SOX15可通過下調Wnt/β-caten信號通路，影響結直腸癌細胞生長[16]；miRNA-155通過調節Wnt/β-catenin信號通路，促進結直腸癌SW-480細胞侵襲[17]；Capn4通過激活Wnt/β-catenin信號通路，促進結腸直腸癌細胞增殖[18]。β-catenin和C-myc是Wnt/β-catenin信號通路的重要成員[19-20]。本研究結果發現，結直腸癌組織中USP33蛋白水平低于癌旁組織，而β-catenin、C-myc蛋白水平高于癌旁組織，結直腸癌組織中USP33蛋白與β-catenin、C-myc蛋白呈負相關，表明USP33的結直腸癌中的作用可能與Wnt/β-catenin信號通路有關。

綜上所述，結直腸癌組織中USP33蛋白與β-catenin、C-myc蛋白呈負相關，USP33可能通過Wnt/β-catenin信號通路在結直腸癌中發揮作用。對USP33和Wnt/β-catenin信號通路在結直腸癌中發生、發展中的具體作用，尚需在接下來的研究中進行細胞及動物實驗進一步明確。UPS33可能通過Wnt/β-catenin信號通路參與結直腸癌的發生、發展，UPS33有望成為結直腸癌的治療靶點和潛在生物標志物。