鹽酸米諾環素軟膏無菌檢查方法的建立

北京市藥品檢驗所 中藥成分分析與生物評價北京市重點實驗室（102206）張光華 江志杰 劉文杰 牛振東

鹽酸米諾環素軟膏的主要成分是鹽酸二甲胺四環素。鹽酸二甲胺四環素對葡萄球菌、肺炎桿菌等革蘭陽性菌以及大腸桿菌、克雷桿菌、腸桿菌等革蘭氏陰性菌具有廣譜抗菌作用[1]。鑒于鹽酸二甲胺四環素強烈的抑菌作用，無菌檢查時如何有效地去除其抗菌活性十分關鍵。鹽酸米諾環素軟膏不能溶解于2015版藥典[2]提供的軟膏劑稀釋劑十四烷酸異丙酯中，經測試，N，N-二甲基甲酰胺（DMF）[3]對樣品有良好的溶解性，以DMF做稀釋劑陽性對照實驗，2015版藥典規定的6種無菌檢查試驗菌株回收比值均小于0.5，表明DMF有微生物毒性，因此用DMF直接溶解樣品很可能導致假陰性結果出現。本研究確立25%DMF水溶液對微生物無毒性，采用25%DMF將鹽酸米諾環素軟膏溶解，薄膜過濾法處理，用0.9%無菌氯化鈉溶液900ml做沖洗液，沖洗3次[4]，消除鹽酸二甲胺四環素的抑菌性。由于目前國內尚無以25%DMF水溶液為軟膏劑稀釋劑的無菌檢查方法的文獻報道，本文描述的無菌檢查方法對其他軟膏劑類產品的無菌檢查有較好的參考作用。

1 儀器與材料

1.1 儀器 無菌隔離器（杭州泰林生物技術設備有限公司HTY-CZ1806B）；集菌儀（杭州泰林生物技術設備有限公司HTY-2000A）；一次性使用的全封閉三聯集菌培養器（杭州泰林生物技術設備有限公司KDGB330）；生化培養箱（BINDER KB720）。電熱脈動真空滅菌器（山東新華XG1.DMXD-0.36）；生物安全柜（熱電1300SERIESA2）；電動吸引器（斯曼峰YX930D）。

1.2 樣品 鹽酸米諾環素軟膏(派麗奧)（批號：1512141，1601071，1601141規格：0.5g/支），由Sunstar INC生產。

1.3 試驗菌種 枯草芽孢桿菌[Bacillus subtilis CMCC（B）63501]；大腸埃希菌[Escherchia coli CMCC（B）44102]；銅綠假單胞菌[Pseudomonas aeruginosa CMCC（B）10104]金黃色葡萄球菌[Staphylococcus aureus CMCC（B）26003]；生孢梭菌[Clostridium sporogenes CMCC（B）64941]；白色念珠菌[Candida albicans CMCC（F）98001]；黑曲霉[Aspergillus niger CMCC98003]。以上菌株均來自中國食品藥品檢定研究院醫學微生物菌種保藏中心。

1.4 培養基和試劑 硫乙醇酸鹽流體培養基、胰酪大豆胨液體培養基、胰酪大豆胨瓊脂培養基、沙氏葡萄糖瓊脂培養基、pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（北京奧博星生物技術有限責任公司）；0.9%氯化鈉注射液（石家莊四藥有限公司）；N，N-二甲基甲酰胺（Merck KGaA色譜純）。

2 方法與結果

2.1 菌液制備 ①接種金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養物（第三代菌）至10ml胰酪大豆胨液體培養基（TSB）中，33℃培養24小時；接種生孢梭菌的新鮮培養物（第三代菌）至硫乙醇酸鹽流體培養基200ml中，33℃培養24小時；接種白色念珠菌的新鮮培養物（第三代菌）至10ml沙氏葡萄糖液體培養基(SDB)中，23℃培養24小時；上述培養物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數小于100cfu的菌懸液。②接種黑曲霉的新鮮培養物（第三代菌）至沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養基上，23℃培養7天，加入5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后，將孢子懸液轉移至無菌試管內，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含孢子數小于100cfu的孢子懸液。

2.2 菌落計數 分別取制備好的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌菌液各1ml，置90mm的無菌培養皿中，注入15～20ml胰酪大豆胨瓊脂培養基，搖勻，待凝固后，置33℃培養3天，菌落計數。取生孢梭菌菌液1ml，注入200ml硫乙醇酸鹽流體培養基厭氧區中33℃培養24小時，計數。分別取上述白色念珠菌及黑曲霉菌液各1ml，置90mm的無菌培養皿中，注入15～20ml沙氏葡萄糖瓊脂培養基，搖勻，待凝固后，置23℃培養5天，菌落計數，結果見附表1。

附表1 菌落計數結果（cfu/ml）

2.3 培養基的適用性檢查

2.3.1 無菌性檢查 取本批硫乙醇酸鹽流體培養基和胰酪大豆胨液體培養基各5瓶，置相應溫度培養14天，結果見附表2，各培養基均無菌生長，培養基的無菌性檢查符合規定。

附表2 培養基無菌性檢查

2.3.2 靈敏度檢查 取每管裝量為12ml的硫乙醇酸鹽流體培養基7支，分別接種附表1所述金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和生孢梭菌菌液1ml各2支，另一支不接種，作為空白對照，培養3天；取每管裝量為9ml的胰酪大豆胨液體培養基7支，分別接種附表1所述枯草芽孢桿菌、白色念珠菌和黑曲霉菌液1ml各2支，另一支不接種，作為空白對照，培養5天。逐日觀察結果，見附表3，空白對照管無菌生長，各加菌的培養基管，陽性對照菌均生長良好，培養基的靈敏度檢查符合規定。

附表3 培養基靈敏度檢查結果

2.3.3 稀釋劑微生物無毒性實驗 ①菌液組：取pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液10ml，分別加入制備好的試驗菌液0.1ml（300～600cfu），混勻，靜置30min，使每1ml稀釋液中含菌量為30～100cfu。分別取此菌液1ml，采用薄膜過濾法，以pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液為沖洗液（每膜不少于100ml），進行細菌計數和霉菌和酵母菌數計數。②稀釋劑對照組：取25% N，N-二甲基甲酰胺10ml，分別加入制備好的試驗菌液0.1ml（300～600cfu），混勻，靜置30min，使每1ml稀釋液中含菌量為30～100cfu。分別取此液1ml，采用薄膜過濾法，以pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液為沖洗液（每膜不少于100ml），進行細菌計數和霉菌和酵母菌計數。

金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌的濾膜貼于胰酪大豆胨瓊脂培養基平板上，置33℃培養5天，逐日觀察計數，生孢梭菌的濾膜加入200ml硫乙醇酸鹽流體培養基厭氧區中33℃培養24小時，計數。白色念珠菌及黑曲霉的濾膜貼于沙氏葡萄糖瓊脂培養基平板上，置23℃培養5天，逐日觀察計數，回收比值均大于0.5，表明25%N，N-二甲基甲酰胺水溶液無微生物毒性。

2.4 方法適用性試驗(薄膜過濾法)

2.4.1 供試品組 取供試品10支，分兩套集菌器進行無菌檢查。每套取本品5支，加至帶玻璃珠的含25%N，N-二甲基甲酰胺400ml的玻璃瓶中，振搖至供試品分散均勻，倒入無菌帶過濾網均質袋中，取濾液全部薄膜過濾，用0.9%無菌氯化鈉溶液900ml沖洗3次，分別將硫乙醇酸鹽流體培養基及胰酪大豆胨液體培養基加入濾器內，每筒100ml，置規定溫度培養。逐日觀察，供試品對照組無菌生長。

2.4.2 試驗組 取供試品5支，加至25% N，N-二甲基甲酰胺400ml中（帶玻璃珠），振搖至供試品分散均勻，倒入無菌帶過濾網均質袋中，取濾液全部薄膜過濾，用0.9%無菌氯化鈉溶液900ml沖洗3次，將硫乙醇酸鹽流體培養基加入濾器內，每筒100ml，分別接種附表1所述金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌和生孢梭菌（每筒加一種菌）。另取本品5支同法操作，將胰酪大豆胨液體培養基加入濾器內，每筒100ml，分別接種附表1所述枯草芽孢桿菌、白色念珠菌和黑曲霉（每筒加一種菌）。置規定溫度培養。逐日觀察，試驗組陽性對照菌生長良好。

2.4.3 陽性菌對照組 另取濾器2套，分別將硫乙醇酸鹽流體培養基及胰酪大豆胨液體培養基加入濾器內，每筒100ml，分別接種附表1所述金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌和生孢梭菌至硫乙醇酸鹽流體培養基中，分別接種附表1所述枯草芽孢桿菌、白色念珠菌和黑曲霉至胰酪大豆胨液體培養基中。置規定溫度培養，逐日觀察，發現試驗組各濾器中試驗菌與陽性對照組比較均生長良好，說明供試品的該檢驗量在該檢驗條件下無抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不計。

2.4.4 陰性對照組 取稀釋液及沖洗液1300ml全部過濾于封閉式濾器中，分別將硫乙醇酸鹽流體培養基及胰酪大豆胨液體培養基分別加入相應的濾器內，每筒100ml，置規定溫度培養14天。逐日觀察，發現陰性對照組無菌生長。

2.4.5 陽性對照菌的選擇 根據供試品特性選擇金黃色葡萄球菌為陽性對照菌。

2.5 結果 供試品組、陰性對照組均無菌生長，試驗組各濾器中試驗菌與陽性對照組比較均生長良好，說明供試品的該檢驗量在該檢驗條件下無抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不計，上述檢查方法可行。三批樣品平行實驗，結果一致。

3 結論

通過本文的研究確立鹽酸米諾環素軟膏的無菌檢查方法為：取供試品10支，分兩套集菌器進行無菌檢查。每套取供試品5支，加至25%N，N-二甲基甲酰胺400ml中（帶玻璃珠），振搖至供試品分散均勻，倒入無菌帶過濾網均質袋中，取濾液全部薄膜過濾，用0.9%無菌氯化鈉溶液沖洗（每膜不少于300ml），以金黃色葡萄球菌為陽性對照菌，依法檢查（中國藥典2015年版四部通則1101），應該符合規定。

25%N，N-二甲基甲酰胺400ml配制：取有機膜過濾后的無菌N，N-二甲基甲酰胺100ml，加滅菌的純化水300ml，混勻。采用經過驗證的無菌檢查方法對25批次樣品進行了無菌檢查，結果均符合規定。

4 討論

鹽酸米諾環素軟膏和紅霉素軟膏等采用的輔料不同，不能溶于藥典提供的軟膏劑溶劑十四烷酸異丙酯中[5][6]。實驗中還試用了10%聚山梨酯80蛋白胨溶液、20%乙醇溶液做溶劑，都不能將鹽酸米諾環素軟膏分散溶解。N，N-二甲基甲酰胺對鹽酸米諾環素軟膏有很好的溶解性，實驗中對N，N-二甲基甲酰胺，50%N，N-二甲基甲酰胺水溶液、30%N，N-二甲基甲酰胺水溶液進行了微生物毒性考察，均有抑菌性。實驗確立25%N，N-二甲基甲酰胺水溶液無微生物毒性，故采用。取樣品10支進行薄膜過濾時，過濾速度不流暢，故將10支樣品分兩套集菌器操作。本研究建立了適合鹽酸米諾環素軟膏無菌檢查的方法，對其他軟膏劑產品建立無菌檢查方法可起到較好的參考作用。