風信子鹿角珊瑚對環境因子的響應研究

馬鴻梅，王云祥，秦傳新，段丁毓，朱文濤，陳丕茂

（1.中國水產科學研究院南海水產研究所，國家農業科學漁業資源環境大鵬觀測實驗站，中國水產科學研究院海洋牧場技術重點實驗室，廣東省漁業生態環境重點實驗室，廣州 510300；2.江蘇海洋大學海洋生命與水產學院，江蘇連云港 222005）

我國珊瑚礁主要分布在南沙、西沙、東沙群島，及海南省、廣東省和臺灣省附近海域，約占世界總量的18.48%［1］。珊瑚礁通常分布在水流交換優良、透明度高、風浪緩和的低濃度溶解無機鹽海區，在海洋生物多樣性保護、漁業資源保護、減輕溫室效應等方面起到了積極的生態作用［2］。近年來，隨著海洋開發活動不斷發展，近海生態環境卻在不斷惡化，如污水的排放、違規采集、炸魚、挖掘再沉積［3］，以及風暴［4］、厄爾尼諾現象［5］、寒潮［6］等因素的影響，使得我國近岸珊瑚礁生態系統退化嚴重。鄒仁林等［7］在廣東大亞灣和廣西北部灣調查發現21屬45種珊瑚，由于經濟生產活動和自然環境變化等原因，珊瑚礁資源退化嚴重。2015年7月王云祥等［8］對大亞灣海域造礁石珊瑚進行普查發現，該海域整體珊瑚覆蓋度為41.15%，最高覆蓋率為55%，最低覆蓋率僅為13%，覆蓋度差異較大，近3年內珊瑚死亡率較高。

影響珊瑚礁生態系統的因子較多，水溫是造成珊瑚白化的一個重要因子［9-10］。相關研究表明，在夏季雨量充沛時，隨著CO2值的不斷升高，經地表徑流的淡水會使珊瑚發生白化［11］；HOEGH等［12］于1999年發文認為，再過80年將會有70%的珊瑚礁生活在酸化海域。過強的紫外線輻射也會迫使蟲黃藻脫離珊瑚，而泥沙或者大型藻類的覆蓋也會造成珊瑚的窒息性死亡［13］。因此，本研究以大亞灣海域土著珊瑚風信子鹿角珊瑚（Acropora hyacinthus）為研究對象，通過正交試驗探討溫度、鹽度、光強、pH對珊瑚生長以及蟲黃藻（Zooxanthella）數量的影響，探討風信子鹿角珊瑚對環境因子變化的響應模式，篩選其最適生長環境條件，以期為大亞灣珊瑚資源保護提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗珊瑚的采集與暫養條件

風信子鹿角珊瑚采自深圳南澳島及周邊水域（22°33′50.78″～22°40′38.18″N、114°30′35.62″～114°33′26.90″E），實驗用海水取自七星灣天然海水，將現場采集到的活體珊瑚迅速放入暫養桶，氧氣泵供氧，運輸期間暫養桶避光。1 h后到達暫養車間，將珊瑚樣品放入暫養池（4 m×3 m×1.5 m），同時用氧氣泵供氧，保持水流循環，暫養車間棚頂為透明玻璃板。陰雨天期間，暫養池上方距離水面1 m安裝有5盞120 W藍色光源的金屬鹵化燈，當車間內的光照強度不足1 500 lx時，開啟金屬鹵化燈，日落后關閉光源，光照時間同野外環境保持一致。暫養5～7 d后，珊瑚觸手完整伸展時即可開始實驗。1組珊瑚實驗完畢后，將珊瑚放回到暫養池中，與未進行過實驗的珊瑚分開擺放。

1.2 實驗方法

將實驗用珊瑚放入20 cm×30 cm×20 cm的有機玻璃箱中，待珊瑚狀態穩定不釋放粘液后，放入光照培養箱中進行實驗。實驗按照L25（56）正交表進行，設計了4個環境因子（溫度、pH、光強、鹽度），每個環境因子5個梯度，共計25組實驗（表1），每組實驗設置3個重復，每個梯度持續觀測5 d，每天上午9∶00拍照觀測珊瑚的形態，在第5天用剪刀截取珊瑚一個分枝（30～40 cm2），于顯微鏡下通過血球計數板統計蟲黃藻數量。實驗期間分別在0、4、12、24、72、120 h采集水樣，依據《海洋監測規范》（GB12763.4—2007）中的實驗方法，用靛酚藍法測定水中氨態氮濃度（NH+4-N），用抗壞血酸還原鉬藍法測定活性磷濃度（PO3-4-P）。

表1 L 25（56）正交表實驗方案表Tab．1 L 25（56）orthogonal experiment table

1.3 樣品處理

實驗進行至第5天時，用剪刀直接在水中取樣，盡量減少珊瑚裸露在空氣中的時間，迅速放入預先準備好的采樣瓶中，并編號記錄，將剩余珊瑚放回原暫養池。采集好的珊瑚樣品逐一取出并用鋁箔紙包裹，放入4℃冰箱保存30 min，去除表面粘液。然后將鋁箔紙沖洗干凈，烘干準備稱重，取珊瑚池中的清潔海水經0.45μm濾膜過濾，置于洗牙器中，沖洗珊瑚至水螅體分離骨骼，準確量取沖洗液體積。搖勻沖洗液，再取9 mL沖洗液加入1 mL甲醛溶液（10%）放入10 mL離心管中，1 h內將其他珊瑚樣品全部處理完后，再把全部盛有沖洗液的離心管放入離心機中離心10～15 min，速度設為4 000 r·min-1。離心后取上清液，置于血球計數板中統計蟲黃藻的單位面積個數。

1.4 數據處理

珊瑚表面積共生蟲黃藻密度采用以下公式計算：

式中，D：共生蟲黃藻密度；C：共生藻濃度；V：沖洗液體積；M：包裹在珊瑚樣品外的鋁箔重量；90%：固定液中原液比例；G：鋁箔單位面積質量。通過6個相等面積的方格計算鋁箔平均單位面積質量，用包裹珊瑚表面的鋁箔間接估算珊瑚的表面積。

2 結果與分析

2.1 不同環境因子對風信子鹿角珊瑚蟲黃藻密度的影響

實驗結果表明（圖1，表2），當水溫超過30℃后，珊瑚在短時間內出現白化；水溫在15℃時，珊瑚體內共生蟲黃藻平均密度為2.698×106個·cm-2（圖1-a）。pH為5.1時，珊瑚在4 h即出現蟲黃藻脫落現象，在24 h后水體呈現淡黃色，至120 h珊瑚已瀕臨死亡，出現大面積的白化（圖1-b）；隨pH值上升，珊瑚狀態逐漸轉好，pH為8.3時，蟲黃藻密度最高達到2.576×106個·cm-2；但當水體中pH超過9.0時，4 h后珊瑚表面覆蓋有一層白色薄膜，蟲黃藻脫離表面，12～24 h即發生白化死亡。風信子鹿角珊瑚對低鹽環境有一定耐受性，對高鹽環境則反應較為激烈。當鹽度為33時，蟲黃藻密度最高為2.418×106個·cm-2（圖 1-c）；當鹽度繼續升高，蟲黃藻數量隨之減少，在鹽度為37時，蟲黃藻密度下降60%，至鹽度升高到43時，珊瑚48 h內白化死亡。在低鹽度環境，蟲黃藻密度隨鹽度降低呈緩慢下降狀態；鹽度為23時，珊瑚在4 h時開始分泌粘液，24 h時蟲黃藻已開始脫離水螅體，至實驗結束，水體呈現淡黃色，但珊瑚并未完全白化死亡。光強因子對蟲黃藻密度的影響差異不顯著，為次要因素。當光強在6 000 lx時，蟲黃藻密度最高為2.050×106個·cm-2；當光強為最低（0 lx）和最高（12 000 lx）時，5 d實驗未對珊瑚造成明顯影響：光強為0 lx時，珊瑚48 h后觸手不再伸展，至實驗結束后，珊瑚與水體均無顯著變化；當光強最高為12 000 lx時，至實驗結束珊瑚觸手正常伸展，但有部分蟲黃藻逐漸脫離宿主，珊瑚顏色變淺，水體中可見輕微的淡黃色，蟲黃藻密度為 1.736×106個·cm-2，顯著低于6 000 lx時蟲黃藻密度，可見珊瑚在強光照射下通過降低蟲黃藻密度以維持正常的光合作用水平。

表2 各試驗組蟲黃藻密度Tab．2 Coral Zooxanthella density（×106個·cm-2）

圖1 環境因子變化對蟲黃藻數量的影響Fig．1 Effects of different environmental factors on the number of Zooxanthella

2.2 環境因子變化對NH+4-N濃度的影響

根據以上不同環境因子對蟲黃藻數量的影響可以得出，在水溫25℃、鹽度33、pH 8.3、光照6 000 lx環境下蟲黃藻的數量達到最高值，因此篩選這4個環境指標，觀察珊瑚代謝對NH+4-N濃度的影響。結果表明：溫度為25℃時，隨著鹽度、pH、光強的變化，第11組與第15組差異顯著（P＜0.05）。第11組限制性因素為鹽度43、pH 5.1，光強6 000 lx，24 h時NH+4-N開始顯著增長，72 h后珊瑚瀕臨死亡，水體表現為水質惡化伴有腥臭味出現，至實驗結束NH+4-N濃度顯著升高（P＜0.01）；第15組限制性因子為鹽度37、pH 9.5、光強4 000 lx，在72 h時NH+4-N開始出現放量式增長，可見高pH水環境對珊瑚造成嚴重的危害（圖2-a）。鹽度為33時，隨著溫度、pH、光強的變化，第6、17組變化差異明顯（P＜0.05），第6組限制因子為溫度21℃、pH 5.1、光強4 000 lx，在酸性水體中珊瑚表現出一定范圍內的耐受力，本組中水體的NH+4-N濃度在120 h時達到最高，珊瑚白化；第17組限制因子為溫度29℃、pH 6.3、光強12 000 lx，在12 h時NH+4-N濃度開始升高，72 h時出現峰值，珊瑚死亡（圖2-b）。pH 8.3時，隨著溫度、鹽度、光強的變化，第19、24組NH+4-N濃度變化差異顯著（P＜0.05），第19組限制因子為溫度29℃、鹽度43、光強4 000 lx，至72 h NH+4-N濃度上升至峰值，即發生白化；第24組限制因素為溫度35℃、鹽度29、光強6 000 lx，珊瑚在12 h時白化，72 h時水體中NH+4-N濃度最高，珊瑚出現死亡（圖2-c）。光強為6 000 lx時，隨著溫度、鹽度、pH的變化，第 11、20組NH+4-N濃度變化差異顯著（P＜0.05），第11組限制因素為pH 5.1，120 h時水體中NH+4-N達到最高，珊瑚死亡；第20組限制性因子為pH 9.5，珊瑚在48 h內出現白化，72 h時水體NH+4-N濃度升高，珊瑚死亡（圖2-d）。

2.3 環境因子變化對PO3-4-P濃度的影響

圖2 環境因子變化對NH+4-N濃度的影響Fig．2 Effects of coral metabolism on the concentration of NH+4-N under different environmental factors

通過觀察珊瑚代謝對PO3-4-P濃度的影響發現，水溫25℃下，第11、15組差異顯著（P＜0.05），第11組在24 h時，PO3-4-P開始顯著性增長，且PO3-4-P出現快速增長的時間早于NH+4-N，72 h后珊瑚白化，出現死亡（P＜0.01）；第15組在72 h時PO34--P開始出現放量式增長（圖3-a）。鹽度33條件下，第 6、17、25組 PO34--P濃度的變化差異顯著（P＜0.05），第6組在120 h時濃度明顯升高，珊瑚出現白化；第17組72 h時PO34--P濃度顯著升高；第25組的主要限制因子為高溫，pH為9.5，在12 h時珊瑚即發生白化，水體中PO34--P濃度顯著上升（圖3-b）。pH 8.3條件下，第4、19、24組水體中PO34--P濃度變化差異顯著（P＜0.05），第4組的PO34--P在低溫、高鹽下釋放較快，24 h時升至峰值，之后開始下降；第19組在4 h后-P開始釋放，至72 h上升至峰值，即發生白化，本組PO34--P濃度變化趨勢與NH4+-N濃度變化趨勢相同；第24組珊瑚在高溫狀態下反應劇烈，短時間內水體中PO34--P未見顯著性增長（圖3-c）。光強為6 000 lx的各組中，第11組珊瑚72 h出現死亡，120 h水體PO34--P濃度顯著升高；第20組珊瑚在48 h內白化，72 h時水體PO34--P濃度達到峰值，珊瑚出現白化；第24組珊瑚在72 h時白化，水體中PO34--P濃度達到峰值（圖3-d）。

圖3 環境因子變化對PO3-4-P濃度的影響Fig．3 Effects of coral metabolism on the concentration of PO3-4-P under different environmental factors

3 討論

造礁石珊瑚對外界環境的改變較為敏感，其自適應過程主要體現為氮磷水平及其蟲黃藻含量的變化，適宜的生長溫度一般為23～28℃［14］，大亞灣海域年均最低溫14～15℃［15］。實驗中25℃時珊瑚單位面積蟲黃藻密度最高，水體中營養鹽濃度呈現出先下降后升高趨勢，15℃時珊瑚的蟲黃藻密度和營養鹽濃度變化均不顯著。在日本海生活的石珊瑚中22.5%的種類能夠忍受10.5℃低溫，超過48%的種類可以忍受14.1℃的低溫［16］。雷新明等［9］研究富營養化與共生藻關系中指出，NH+4-N濃度增高的水體會影響珊瑚的光合效率，從而降低珊瑚的蟲黃藻密度與葉綠素含量。本研究中，珊瑚在29℃的水體中經過96 h培養后開始分泌粘液，此時水體中NH+4-N濃度顯著高于72 h時的NH+4-N濃度（P＜0.01），120 h后珊瑚基本白化。珊瑚白化程度主要是由外界干擾所引起的蟲黃藻流失造成［17］，相關研究指出，當溫度超過34℃時，珊瑚體內的細胞功能完全紊亂，共生藻的分解速度加快，隨著珊瑚粘液的分泌流入海水中，珊瑚光合作用完全停止［18］。

鹽度是影響造礁石珊瑚存活的重要因子，適宜珊瑚生長的鹽度范圍是27～40，低鹽環境可能會對珊瑚造成嚴重影響［19］。本研究中風信子鹿角珊瑚最適鹽度是33，當珊瑚處在鹽度29的環境中，單位面積共生藻密度為 1.907×106個·cm-2，顯著低于鹽度33時的水平。已有研究指出，鹽度在小范圍內的波動并不會短時間內致珊瑚白化死亡，但是珊瑚不具備調節滲透壓的能力［20］，因而如果珊瑚長時間置于此環境會抑制珊瑚的光合作用效率，進而影響珊瑚的鈣化速率，最終發生白化死亡。珊瑚生存環境一般為偏堿性，pH在8.0～8.5之間為正常水平［21］。珊瑚可以通過調節自身的酸堿度來適應環境，在pH偏低情況下珊瑚依然可以存活［22］。但是當pH下降至6.3以下時，珊瑚單位面積蟲黃藻數量迅速下降，說明當水質一旦超過珊瑚的耐受范圍，無論傷害到宿主還是蟲黃藻都會引起共生藻脫離宿主。SUZUKI等［23］于日本野外的實驗證實，珊瑚礁在夜晚會發生凈溶解。大洋區珊瑚發生溶解現象較為少見，海岸帶附近溶解現象較為普遍［24］。而當海洋酸化問題與溫度升高協同作用時，珊瑚將會在更低的溫度下發生白化［25］。海水溫度的升高將使珊瑚發生更多的不可逆疾病與白化問題，未來的珊瑚礁區多樣性將會受到不可忽視的影響［26］。FINE等［27］研究指出，有骨骼的珊瑚在酸化的實驗條件下能夠以海葵狀的形式維持基本的生命功能，包括生殖能力，并且當它們重新進入正常的海洋環境時，能夠恢復骨骼的建造。因此在一定的強度范圍內，并非所有珊瑚都受到海洋酸化的脅迫。

光強是影響珊瑚鈣化效率的重要因子，在適當的光照強度下，蟲黃藻可將光合作用所吸收的95%的碳轉移至水螅體中，為宿主的不斷鈣化提供必不可少的能源［28］。正是由于蟲黃藻的多樣性對光照強度有著不同需求，造成了珊瑚垂直分布的多樣性［29］。在本實驗中，珊瑚在6 000 lx光強時單位面積蟲黃藻密度最高，而珊瑚處在無光照環境中時，蟲黃藻密度相對大于低光強（4 000 lx）時。在沉積物較多、透明度低的海區，珊瑚會通過增加共生藻密度以增加葉綠素-a含量的方式來維持其在惡劣環境中的生存［30］。DUBINSKY等［31］的研究證實，當珊瑚面對高強度光照時，珊瑚體內的共生藻濃度和葉綠素-a濃度都會出現較為明顯的下降，以降低光合效率，保護光合器官。當光強超過珊瑚承受的正常水平時，珊瑚可調整體內的熒光蛋白含量，將吸收的多余光能以熒光方式轉移出體表，可以起到保護光合系統的目的。

綜上所述，溫度為25℃、鹽度為33、pH為8.3、光強為6 000 lx時，是風信子鹿角珊瑚最適宜存活條件。近年來由于經濟生產活動和氣候變化，珊瑚礁資源正面臨著前所未有的生存挑戰，大亞灣經濟快速發展的同時，水環境污染應該引起高度重視。本研究確定了風信子鹿角珊瑚的最適環境因子，可以為將來室內培育珊瑚以及野外珊瑚移植提供參考依據。