暗紋東方鲀抗苗勒氏管激素Ⅱ型受體基因的克隆、生物信息學及表達分析

高瑩瑩，胡 鵬，劉新富，黃 濱，劉 濱

（1.中國水產科學研究院黃海水產研究所，山東青島 266071；2.上海海洋大學水產與生命學院，上海 201306；3.內江師范學院，四川內江 641100）

暗紋東方鲀（Takifugu obscurus）又名河鲀，是我國長江中下游地區重要淡水養殖種類，其營養價值豐富、肉質鮮美，名列長江“四大名魚”之首。過去因受國內市場禁止銷售的限制，大多數養殖河鲀以出口貿易的方式進行銷售，因此養殖產量多年以來一直在10 000 t左右徘徊［1］，但隨著人工養殖技術的不斷優化，養殖規模越來越大，2015年養殖產量首次突破23 000 t［2］。2016年9月農業部辦公廳和國家食品藥品監督管理總局聯合發布《關于有條件放開養殖紅鰭東方鲀和養殖暗紋東方鲀加工經營的通知》，解除了自1990年開始實施的暗紋東方鲀不準市場流通的禁令，國內市場的開放為暗紋東方鲀產業的二次創業和可持續發展提供了新的契機。

暗紋東方鲀雌雄個體體長生長規律相似，但在2.5齡前雄魚體質量生長速度大于雌魚［3］，且雄魚精巢被認為是難得的珍貴食材，有“西施乳”的美譽。一對精巢的價值甚至超過雄魚本身，養殖全雄苗種的利潤是養殖普通苗種的1.5倍以上。因此，生產和養殖全雄暗紋東方鲀，可以大幅度提高我國暗紋東方鲀的養殖經濟效益。但目前有關暗紋東方鲀的性別調控機制及其性控技術的研究還較少。

抗苗勒氏管激素Ⅱ型受體（anti-Müllerian hormone receptorⅡ，Amhr2）基因屬于 β-轉化生長因子（transforming growth factor-β，TGF-β）超家族成員，其編碼的是一種絲氨酸／蘇氨酸激酶受體。Amhr2在抗苗勒氏管激素（anti-Müllerian hormone，Amh）信號傳遞通路中起到關鍵的介導作用［4-6］，Amh只有與具有絲氨酸／蘇氨酸激酶活性的Amhr2結合后才能進一步結合并激活下游信號Smad蛋白，從而發揮生理功能［6-7］，如在哺乳動物中參與早期性別決定和性別分化的調控 等 過 程［4，8-9］，在 日 本 鰻 鱺 （Anguilla japonica）［10］、青 鳉 （Oryzias latipes）［11］和 黑 鯛（Sparus macrocephlus）［12］等魚類中通過抑制生殖細胞增殖和類固醇激素的合成等過程參與性腺的發育。在紅鰭東方鲀（Takifugu rubripes）的研究中進一步發現，amhr2基因激酶結構域中的一個SNP位點與其性別決定相關，雌性個體為純合子 （His／His384），雄 性 個 體 為 雜 合 子 （His／Asp384）［13］。本課題組前期研究也發現，暗紋東方鲀amhr2基因同樣存在一個類似的與性別相關的SNP位點，并據此建立了暗紋東方鲀的雌雄幼魚性別鑒定技術［14］。金武等［15］的研究也證實了在暗紋東方鲀1齡成魚的amhr2中，該SNP位點與性別表型存在顯著的相關性，雌性個體基因型為純合子CC，雄性個體基因型為雜合子CG。在此基礎上，本實驗以暗紋東方鲀為研究對象，應用RACE克隆技術，克隆得到amhr2的全長cDNA序列，并通過對暗紋東方鲀amhr2基因的序列結構、相關生物信息學特征及不同組織和不同發育期中mRNA表達情況的研究，為進一步研究其功能奠定基礎，同時為暗紋東方鲀性別調控過程中的分子機制研究提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗用暗紋東方鲀樣本來源于江蘇省南通市中洋集團股份有限公司，暗紋東方鲀親魚促熟培育后，采用LHRHa催產，人工授精獲得受精卵，受精卵在17.5～18.5℃水溫孵化7 d后，將孵化的仔魚布池培育，培育水溫為18.0～22.0℃。采用車間內循環水系統養殖，每日投喂2～3次，水溫為22～26℃。分別采集孵化后60、90、120、150日齡幼魚，每個日齡各取3尾魚，體長分別為（7.2±0.8）cm、（8.5±0.6）cm、（10.3±0.9）cm和（14.4±1.1）cm，分別剖取卵巢和精巢組織，保存在RNA Store液中備用，另外每個個體（或每尾魚）取少量肌肉組織，-20℃冷凍保存，用于DNA提取。

此外，隨機選取1齡雌魚和雄魚各3尾，分別剖取下丘腦 、腦、垂體、性腺、心臟、肝臟 、膽、胃、腸、肌肉、眼等組織，保存在RNA Store液中備用。

1.2 暗紋東方鲀遺傳性別鑒定

采用天根TIANamp Marine Animals DNA kit提取樣品肌肉的基因組DNA，利用NanoDrop2000超微量分光光度計測量DNA的濃度和OD260／OD280比值，1.0%瓊脂糖電泳檢測DNA的完整性。根據暗紋東方鲀amhr2激酶結構域內存在一個與性別連鎖的錯義突變SNP位點，分別設計了擴增雌雄性別差異基因序列的引物和含有針對SNP位點的錯配堿基的下游PCR引物，上游引物為 5′-GATGTTCCGCCATCCTGCATTC-3′，下游引 物 為 5′-CTGCCTGCTGCACAGAGCACCTG-3′，含錯配堿基的下游引物為 5′-GATACCATTTGTTGTGAAACTC-3′，采用雙重 PCR方法鑒定暗紋東方鲀幼魚的遺傳性別，其中第一輪PCR擴增得到的基因片段送至上海生工生物工程有限公司進行測序，第二輪PCR產物經過瓊脂糖凝膠電泳后，雄性個體在270 bp處出現條帶，而雌性個體不存在條帶（圖1），以此來判斷各個樣品的遺傳性別。

圖1 暗紋東方鲀PCR產物的電泳圖Fig．1 The electrophoresis of PCR products in T．obscures

1.3 暗紋東方鲀amhr2全長cDNA序列的克隆

提取精巢組織總RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性，NanoDrop2000超微量分光光度計測量RNA的濃度。根據已知魚類amhr2的保守序列，利用DNAMAN軟件設計擴增引物，上游 引 物 為 5′-GGCTACCAGAGAAGCTACAAC-3′，下游引物為 5′-TCCCAGCTCAGAGACAGATGGC-3′，克隆得到暗紋東方鲀amhr2基因的核心片斷序列。根據獲得的片段設計特異性引物，5′-RACE 的 特 異 性 引 物 為 5′-TCCCAGCTCAGAGACAGATGGC-3′， 5′-TGGACTGGATGGCAACAATCA-3′，3′-RACE的特異性引物為 5′-GATGTTCCGCCTTCCTGCATTC-3′，5′-ACGTTGCGCTACATGTCCCCTG-3′，進行全長序列擴增。PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，根據膠回收試劑盒（天根，北京）說明書對目的條帶切膠后進行純化回收。切膠回收的PCR產物與pEASY-T3載體（全式金生物，北京）連接，采用熱激法將5μL連接產物轉化至20μL Trans1-T1感受態細胞（全式金生物，北京），在含氨芐的LB固體培養基中，37℃過夜培養，挑取單一克隆菌落繼續培養2 h。菌液PCR鑒定后，將含有目的條帶的菌液送至上海生工生物工程有限公司測序。

采用DNAstar軟件將5′-RACE、保守片段和3′-RACE的測序結果進行拼接，獲得暗紋東方鲀amhr2基因的cDNA全長序列。

1.4 暗紋東方鲀Amhr2序列分析

采用BLAST程序對獲得的全長序列進行同源性分析并推斷其開放閱讀框序列；借助ExPASy ProtParam工具推斷Amhr2蛋白質的基本理化性質，包括相對分子質量、等電點、氨基酸組成和總平均親水性等；利用PSORTⅡ Prediction工具定位蛋白質的亞細胞；利用SignalIP 4.1程序預測信號肽結構；利用NetPhos 3.1 Server程序預測磷酸化位點；利用NetNGlyc 1.0程序預測糖基化位點；采用ExPASy ProtScale工具分析Amhr2蛋白質的疏水性；采用TMHMM Server 2.0工具分析跨膜區；采用SMART和PROSITE工具分別分析氨基酸序列的保守結構域及其功能域位點；借助SOPMA和SWISS-ODLE工具分別預測Amhr2蛋白質的二級結構和三級結構。使用DNAMAN軟件進行編碼蛋白質的氨基酸多重序列比對分析；利用MEGA 5.1軟件基于鄰位相接法（1 000 runs）構建系統進化樹。

1.5 暗紋東方鲀amhr2基因表達分析

采用Real-Time PCR方法檢測amhr2在暗紋東方鲀雌魚和雄魚不同組織和不同發育期性腺組織中的表達量。取出RNA Store保存液中保存的雌魚和雄魚各組織及不同發育期的性腺組織，提取總RNA，反轉錄生成第一鏈cDNA。設計特異 性 引 物， 上 游 引 物 為 5′-GTGCTTGTGAGAGCCGATG-3′，下游 引 物 為 5′-AACTGATGCCGTGGAGGAG-3′，以第一鏈 cDNA稀釋梯度作模板，β-actin作內參基因，內參基因上游引物為 5′-CAGGGAGAAGATGACCCAGA-3′，下游引物為 5′-CATCACCAGAGTCCATGACG-3′，做模板cDNA稀釋倍數的標準曲線，尋找最佳模板稀釋倍數，隨后以最佳稀釋倍數cDNA為模板，檢測amhr2在暗紋東方鲀雌魚和雄魚不同組織和不同發育期中的表達變化。實驗步驟參照SYBR?Premix Ex TaqTM（TaKaRa）試劑盒實驗操作說明，在Line Gene 9600型實時熒光定量PCR儀上進行。

實時熒光定量PCR獲得一系列CT值，數據分析采用2-ΔΔCT法，用 SPSS 16.0軟件進行數據的統計分析，分析方法為單因素方差分析，即當P＜0.05時為差異顯著，結果表示為平均值±標準誤。

2 結果與分析

2.1 暗紋東方鲀amhr2基因全長cDNA序列克隆

通過PCR反應得到336 bp長度的CDS片段，采用RACE技術獲得暗紋東方鲀amhr2基因的5′和3′序列，序列拼接后得到 1 868 bp的cDNA全長序列。此序列編碼513個氨基酸，包括5′非編碼區133 bp和3′非編碼區193 bp，開放閱讀框1 542 bp（圖2）。且雄性個體amhr2H384是一個SNP位點，在第384位氨基酸處由組氨酸突變為天冬氨酸，位于激酶結構域內（圖3）。預測的蛋白相對分子量為56.87 Ku，等電點為6.73，分子式為C2497H3952N706O753S30。成熟蛋白質中含有帶負電荷的酸性氨基酸（Asp+Glu）和帶正電荷的堿性氨基酸（Arg+Lys）分別為52和49個。不穩定系數為52.14，屬于不穩定蛋白。GRAVY（grand average of hydropathicity）為 -0.118，屬于親水性蛋白。

2.2 暗紋東方鲀Amhr2蛋白質的結構特征及功能預測

圖2 暗紋東方鲀amhr2基因cDNA及其編碼的氨基酸序列Fig．2 The cDNA sequence and deduced amino acid sequence of amhr2 gene in T．obscures

亞細胞定位結果發現，Amhr2蛋白質定位于內質網、高爾基體、線粒體、分泌系統小泡、細胞膜、細胞外（包括細胞壁）的概率分別為44.4%、11.1%、11.1%、11.1%、11.1%、11.1%，由此可推測Amhr2蛋白質最有可能定位于內質網，屬于分泌蛋白。信號肽預測結果顯示，Amhr2蛋白質在近N-端含有長度為21個氨基酸（1aa～21aa）的信號肽結構（圖4-a）。糖基化位點預測的結果表明，其可能存在3個潛在的N-糖基化位點。磷酸化位點預測的結果表明，43個絲氨酸（Ser）、16個蘇氨酸（Thr）和8個酪氨酸（Tyr）可能會成為蛋白激酶磷酸化的位點。疏水性預測結果顯示，Amhr2蛋白質在100～200氨基酸處含有1個典型的疏水性區域。跨膜區結構預測結果顯示，該蛋白在137～154氨基酸處含有1個跨膜結構域，1～136位氨基酸在胞內，155～513位氨基酸在胞外（圖4-b）。

保守結構域預測結果表明，Amhr2蛋白在1～21、137～154和194～490氨基酸殘基處分別存在信號肽、跨膜區域和STYKc保守結構域（圖5-a）。功能域預測結果表明，194～497氨基酸殘基處為蛋白激酶區域；200～208氨基酸處為核苷酸磷酸鹽結合位點；221位氨基酸為ATP配體結合位點；321位氨基酸為質子受體活性位點（圖5-b）。

二級結構預測結果顯示，Amhr2二級結構中α-螺旋（h）占38.40%，β-折疊（e）占 14.81%，β-轉角（t）占 5.46%，無規卷曲（c）占 41.33%（圖6），這種二級結構組成可使得Amhr2蛋白的構象多樣化。三級結構同源建模分析結果顯示，建模范圍為188～498位氨基酸，覆蓋率為60%，這表明該結構域的保守性比較高。由于到目前為止數據庫中還沒有其他物種Amhr2蛋白的三維模型，因此將暗紋東方鲀Amhr2蛋白的三維模型（圖7-a）與屬于同一家族的人骨形態發生蛋白BMPR2的三維模型（圖7-b）相比較，發現其構型比較相似，這說明Amhr2具有類似于BMPR2構型的三級結構，且在不同的物種中具有保守性。

圖3 暗紋東方鲀PCR產物的測序峰圖Fig．3 The PCR product sequencing peak figures of T．obscures

圖4 暗紋東方鲀Amhr2蛋白質的信號肽剪切位點（a）和跨膜區域（b）Fig．4 Signal peptide splice site（a）and transmembrane region（b）of Amhr2 protein in T．obscures

圖5 暗紋東方鲀Amhr2蛋白質的保守結構區域（a）和功能域（b）Fig．5 Amhr2 protein conserved domain（a）and functional domain（b）in T．obscures

圖6 暗紋東方鲀Amhr2蛋白質的二級結構Fig．6 Secondary structure of Amhr2 protein in T．obscures

圖7 暗紋東方鲀Amhr2蛋白質（a）和人類BMPR2蛋白質（b）的三級結構模型Fig．7 Amhr2 protein of T．obscures（a）and BMPR2 protein of Homo sapiens（b）tertiary structure

2.3 暗紋東方鲀amhr2基因的同源性分析及系統發育分析

登錄NCBI數據庫，將暗紋東方鲀amhr2的核苷酸序列與已知魚類的序列進行BLAST比對，結果顯示暗紋東方鲀amhr2與紅鰭東方鲀（GeneBank： NM_001280009.1）、舌 齒 鱸（Dicentrarchus labrax，GeneBank：JQ801443.1）和青鳉（GeneBank：NM_001104896.1）的相似度分別為99%、73%和69%，這說明克隆得到的序列是amhr2基因。同時利用DNAMAN軟件對暗紋東方鲀amhr2編碼的氨基酸序列與GeneBank上其他8種動物的序列進行氨基酸多重序列比對與分析，結果發現近C-末端區域內的氨基酸序列比較保守，這表明此區域可能與amhr2生理功能的發揮有關（圖8）。根據暗紋東方鲀和其他物種的Amhr2氨基酸序列進行系統發育分析，結果表明，系統進化樹可分為兩個大支：哺乳類聚為一大支，所有魚類聚為另一大支，其中暗紋東方鲀位于魚類這個分支中，且與紅鰭東方鲀緊密聚為一個小分支，親緣關系最近，與人和鼠等較高等脊椎動物的親緣關系最遠，這表明暗紋東方鲀amhr2基因的系統進化地位與傳統的物種進化基本一致（圖9）。

圖8 暗紋東方鲀Amhr2與其他物種氨基酸序列比對圖Fig．8 Multiple alignment of the deduced amino acid sequence of T．obscures Amhr2 with the corresponding sequences from other species

圖9 不同物種Amhr2氨基酸序列的系統進化樹Fig．9 Phylogenetic tree of Amhr2 amino acid sequence from different species

2.4 暗紋東方鲀amhr2基因的表達特征分析

本研究對暗紋東方鲀amhr2的組織表達分析發現，amhr2僅在性腺中表達，與其他組織有顯著性差異（P＜0.05），且卵巢中的表達量明顯高于精巢（圖10）。進一步對不同發育期性腺中amhr2的表達水平進行分析，結果表明，amhr2的表達量在幼魚不同發育期精巢和卵巢中均呈現出先降低再迅速升高的表達趨勢，不同之處在于體長為60日齡和120日齡時精巢中amhr2的表達量大于卵巢中的表達量，90日齡和150日齡時的情況則相反（圖11）。

圖10 暗紋東方鲀amhr2在不同組織中的相對表達Fig．10 Relative expression of amhr2 in different tissues of T．obscures

圖11 暗紋東方鲀amhr2基因在不同發育期性腺組織的相對表達Fig．11 Relative expression of amhr2 in gonad tissues at different developmental stages of T．obscurus

3 討論

3.1 暗紋東方鲀Amhr2蛋白的功能域分析

Amhr2是 β-轉化生長因子（TGF-β）超家族的Ⅱ型受體，包含一個結合Amh的N末端胞外結構域（ECD）、跨膜結構域和具有絲氨酸／蘇氨酸激酶活性的胞內結構域［16］。Amh信號通路在雄性性別分化過程中發揮著十分重要的作用，主要通過具有絲氨酸／蘇氨酸激酶活性的兩種類型的受體（Ⅰ型和Ⅱ型受體）及兩種細胞質效應物R-Smads（受體調節型蛋白Smads）和Smad4（普通型蛋白Smad）調控靶器官、組織和細胞的發育、分化以及凋亡等生物學過程［7］。其作用機理是Amhr2與配體Amh結合后，結合并磷酸化I型受體，進一步激活下游信號R-Smads蛋白，使得RSmads蛋白發生磷酸化并與Smad4蛋白相互作用，形成異源寡聚體，將Amh信號轉導至核內，與靶基因啟動子上的Smad結合元件（SBE）結合，從而調節哺乳動物下游基因的轉錄［16-20］。據報道，Amh／Amhr2信號通路可能存在兩種決定性別的調控機制，一種機制是通過減少生殖細胞的數量，來促進睪丸的發育［21］，與這一假設相一致的是高溫誘導的河豚生殖細胞退化與卵巢體細胞的雄性化有關［22］；另一種機制是對芳香化酶活性產生拮抗作用［23］，眾所周知芳香化酶是一種雌性激素合成酶，對魚類卵巢分化具有十分重要的作用，因此，Amh／Amhr2信號通路抑制芳香化酶活性可能導致河豚的睪丸形成。經過本研究的生物信息學分析，暗紋東方鲀的Amhr2蛋白含有一個十分保守的STYKc蛋白激酶結構域（serine／threonine／tyrosine protein kinase domain），位于第194～497位氨基酸殘基處，在此結構域內含有23個絲氨酸、6個蘇氨酸和3個酪氨酸磷酸化位點以及2個潛在的N-糖基化位點，200～208氨基酸處為核苷酸磷酸鹽結合位點，221位氨基酸為ATP配體結合位點，321位氨基酸為質子受體活性位點，383位氨基酸為性別相關SNP位點，這些位點構成了STYKc蛋白激酶結構域的功能元件，可能使amhr2基因的STYKc蛋白激酶結構域在Amhr2與配體Amh結合的過程中發揮重要的作用，從而調控暗紋東方鲀性別分化和性別特征維持的過程。目前為止尚未有文獻報道過STYKc蛋白激酶結構域的作用機制，這需要更進一步的探索和研究。

3.2 暗紋東方鲀amhr2基因的表達分析

通常情況下，目的基因的組織表達模式能夠在一定程度上反映該基因的生物學功能。據報道，amhr2位于睪丸的支持細胞（sertoli cells）和卵巢的顆粒細胞上，主要在胚胎發育時期苗勒氏管周圍的間質細胞、胎兒性腺的管狀和卵泡結構以及成人睪丸的支持細胞和間質細胞中表達［24-28］；Amh／Amhr2信號通路參與卵巢中卵泡發育的關鍵性階段［29］；amhr2可能在雄性黃顙魚（Pelteobagrus fulvidraco）的性腺發育過程中發揮重大作用［30］，這說明 amhr2基因可能在胚胎發育、性別分化、性腺發育和性別特征維持過程中發揮重要的作用。本研究使用熒光定量PCR法檢測了暗紋東方鲀amhr2基因的組織表達譜，結果發現amhr2的表達模式具有組織特異性，即無論是在雄魚還是在雌魚中，amhr2僅在性腺中表達，且卵巢中的表達量遠遠高于精巢中的表達量，這說明amhr2主要在性腺中發揮作用。據報道在金錢魚（Scatophagus argus）［16］、日本青鳉［31］和尼羅羅非魚［32］中amhr2僅在性腺中表達，這種表達模式與暗紋東方鲀的表達模式相同，唯一不同的是，amhr2在這些魚類精巢中的表達量明顯高于卵巢中的表達量，這種表達模式與黑鯛性腺分化期的表達結果一致［33］；而高長富［4］的研究結果表明，紅鰭東方鲀amhr2基因在卵巢中的表達量最高，約為精巢表達量的40倍，故此推斷amhr2在不同魚類性腺中的表達差異可能與魚的種類和發育期有關。進一步對暗紋東方鲀不同發育期性腺中amhr2的表達水平進行分析，結果表明暗紋東方鲀amhr2在幼魚不同發育期精巢和卵巢中的表達量均呈現出先降低再迅速升高的趨勢，且在60日齡和120日齡時卵巢amhr2的表達量低于精巢，而90日齡和150日齡時卵巢amhr2的表達量則高于精巢，這種情況與紅鰭東方鲀中的報道結果相似，紅鰭東方鲀在23～40日齡時卵巢amhr2的表達量略低于精巢，60～80日齡甚至3齡成魚時卵巢amhr2的表達量顯著高于精巢［5］。本研究中amhr2在暗紋東方鲀不同組織和不同發育期的表達譜分析顯示，amhr2可能參與暗紋東方鲀的早期性腺發育及性腺生理功能的發揮等過程，但amhr2在性別分化過程中的調控機制仍需進一步研究。

綜上所述，本實驗首次克隆得到了暗紋東方鲀amhr2的cDNA全長序列，并利用生物信息學方法分析了其序列結構、蛋白質的結構特點、相關的生物信息學特征以及基因的表達特征，這為深入探索amhr2在暗紋東方鲀性腺發育和性別分化過程中的生物學功能奠定了重要基礎，也為人工繁育中的性別控制工作提供了重要參考依據。