基于響應面分析對堅強芽胞桿菌-CX10發酵黃芪多糖的條件篩選與優化

馬玉俊，梁子敬，李 杰，王 磊，張 凱，張 康，李建喜，張景艷，馬小軍

(1.中國農業科學院 蘭州畜牧與獸藥研究所，蘭州 730050；2.甘肅農業大學 動物醫學院，蘭州 730070)

中藥發酵炮制是借助微生物的作用，在適當的溫度、濕度、水分等條件下對藥物進行發酵，改變其原有的特性，增強或產生新的藥效，擴大應用范圍，以滿足臨床用藥的中藥炮制方法[1]。中藥發酵研究主要有對發酵工藝的優化，發酵原理探究及其質量標準制定等方面。目前發酵黃芪主要有單一菌種發酵和混合菌種發酵，其中單一菌種有益生菌、食用真菌、一些霉菌和鏈球菌；混合菌種主要有嗜酸乳桿菌和糞鏈球菌混合，嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌和青春雙岐乳桿菌聯合，乳酸菌和芽胞桿菌混合，黑曲霉和芽胞桿菌混合[2]。發酵形式有液體發酵和固體發酵，黃芪發酵工藝優化，主要有單因素試驗、正交試驗、響應面優化和其他優化方法。但在實際研究中發酵工藝只是單獨進行，沒有相互結合，這樣不利于發酵工藝的優化。

黃芪(Radix Astragali)屬蝶形花科黃芪屬黃芪種植物，為中國常用的補氣中藥，植物來源分為蒙古黃芪和莢膜黃芪，蒙古黃芪來源于Astragalusmembranaceus(Fish.)Bge. var.mongholicus(Bge) Hsia，莢膜黃芪來源于Astragalusmembranaceus(Fish.) Bge.[3]。在中國主要分布于甘肅、河北、山西、黑龍江、內蒙古等地，以蒙古、山西、河北等地所產的蒙古黃芪質量為上乘[4]。黃芪在中國屬藥食同源植物，即是藥也是食物，已經有兩千多年歷史[5]。黃芪作為傳統中藥材，具有扶正補氣之功效，現代藥學研究表明，黃芪含有多種活性成分，包括黃芪多糖、黃芪皂苷、黃芪黃酮類等[6]。黃芪多糖作為一類大分子成分，包含的單糖種類主要有L-鼠李糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、L-木糖、D-核糖、L-核糖、D-半乳糖、D-葡糖糖和D-甘露糖等[7]，多糖發揮著極其重要的生物功能，具有免疫調節，抗腫瘤、抗動脈硬化[8]，降血糖[9]，抗病毒[10]，治療代謝性紊亂[11]，抗氧化[12]等作用，其中免疫調節功能最為突出[13]。有研究表明，生藥黃芪經益生菌發酵后，黃芪多糖的成分顯著提高，且能提高機體免疫功能[14-15]，魏萌用芽胞桿菌發酵黃芪后，發現發酵液中總黃酮、總皂苷減少，黃芪多糖的量增加了[16]。朱新術等[17]用菌株FGM發酵黃芪后，產物粗多糖得率最可高達27.91%。但是，將益生菌FGM發酵黃芪等試驗成果轉化為大規模生產仍需要大量研究來優化發酵工藝并確定工藝的穩定性，尚利明等[21]利用篩選出來的非乳糖鏈球菌FGM應用于黃芪發酵，提取多糖，優化發酵工藝。結果顯示在溫度39 ℃、PH為5.4、接種量5%和培養時間48 h的條件下多糖質量分數最高。本試驗篩選的菌種為白蟻源堅強芽胞桿菌-CX10，具有高產纖維素酶特性，并且篩選因素較多，因此利用PB設計，單因素試驗和響應面法對發酵黃芪工藝進行優化，進而為黃芪更好的開發利用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材 料

莢膜黃芪根購自蘭州市黃河中藥材市場；堅強芽胞桿菌-CX10(Bacillusfirms-CX10)由蘭州畜牧與獸藥研究所保存；苯酚、濃硫酸、葡萄糖、無水乙醇等均為國產分析純，3,5-二硝基水楊酸(DNS)購自雷根生物。

1.2 儀器和與設備

DFY-500型搖擺試高速中藥粉碎機(溫嶺市大機有限公司)；標準60目篩(浙江上虞市金鼎標準篩具廠)；HH-4型數顯恒溫水浴鍋(常州國華電器有限公司)；BIOF-6010B/G/A全自動發酵罐(上海高機生物工程公司)；LGJ-10F真空冷凍干燥機(北京松源華興科技發展有限公司產品)；酶標儀(SpectraMax○RM2e, Molecular Devices，USA)。

1.3 方 法

1.3.1 菌株復蘇與傳代 配制LB液體培養基，高壓滅菌備用。將凍存的堅強芽胞桿菌-CX10菌株手握復蘇，按照1%的比例，即1 mL菌液接種到50 mL LB液體培養基中，37 ℃培養24 h。經復蘇的菌株繼續按照5%的比例接種到新100 mL LB液體的培養基中，如此傳至第4代,備用。

1.3.2 水提醇沉法提取發酵黃芪總糖 將發酵上清液4 000 r/min離心15 min，上清液放入 4 ℃保存。藥渣加入5倍體積的蒸餾水，用溫水浴法提取2 h，然后離心上清液，合并兩次上清液，旋轉蒸發35 mL發酵液，加入100 mL 95%乙醇4 ℃靜置8 h，4 000 r/min下離心10 min，棄取上清液，用適量無水乙醇沖洗2次，用蒸餾水沖洗后置于冷凍干燥機冷凍，凍干后稱量[20]。

1.3.3 總糖和還原糖標準曲線的建立及其測定 取多糖凍干樣品100 mg，加蒸餾水溶解，定容100 mL制成1 mg/mL溶液進行測定。總糖測定用苯酚-濃H2SO4法，在OD490nm條件下測定；還原糖測定用DNS試劑法，在OD540nm條件下測定[17-18]。兩種標準曲線的建立詳見表1和表2。

以葡萄糖標準質量濃度(X)為橫坐標，OD值(Y)為縱坐標繪制總糖標準曲線，其中Y為OD在490 nm下的吸光度，求得總糖回歸方程Y=5.513 2x-0.164 6(R2=0.994 2)

表1 總糖葡萄糖標準曲線的建立Table 1 Establishment of standard curve of total glucose mL

以葡萄糖標準質量濃度(X)為橫坐標，OD值(Y)為縱坐標繪制標準曲線，其中Y為OD在540 nm下的吸光度，求得還原糖回歸方程Y=4.318 1x+0.069 4(R2=0.995 8)

1.3.4 計算公式 根據測定結果用標準曲線計算樣品溶液中多糖濃度，再計算多糖質量分數

黃芪總糖質量分數(%)=標準曲線所得質量濃度/(樣品質量濃度×1 000)

黃芪還原糖質量分數(%)=標準曲線所得質量濃度/(樣品質量濃度×1 000)

多糖質量分數(%)=總糖質量分數(%)-還原糖質量分數(%)

表2 還原糖標準葡萄糖曲線的建立Table 2 Establishment of reducing sugar standard glucose curve mL

1.3.5 通過Plackett-Burman篩選重要變量 Plackett-Burman Design (PB)設計是選擇影響黃芪多糖生產的重要因素的有效手段，根據PB階乘設計，對每個因素進行兩個水平的評價，最低值和最高值分別以(-)和(+)表示。

設計基于一階線性模型，如下式所示

Y=β0+∑βiXii=1，2，3，…，K

其中Y為響應值(多糖質量分數)，b0為模型的截距，bi為線性系數，Xi獨立變量。11個因素包括化學因素有(葡萄糖、蛋白胨、酵母提取物、乳清粉、KH2PO4、NaCl和黃芪粉)，物理因素有(溫度、pH、時間)和生物因素(接種量)，以多糖質量分數為中心指標進行測定(表3)。所有試驗重復3次，取平均值作為響應面值。

表3 PB設計中使用的變量及其水平值Table 3 Variables and their levels employed in PB design

1.3.6 選擇上升/下降最陡的路徑 PB設計中以95%水平為顯著性因素(P<0.05)，進一步優化使用最陡的上升/下降試驗方法。選擇的試驗上升/下降值在所選值定義的區間，這樣預計的系數比例與實際結果相符。

1.3.7 單因素篩選試驗 由于碳源(g/mL)、氮源(g/mL)、pH、接種量(%)、時間(h)和溫度(℃)都會影響發酵黃芪多糖的提取率。因此，按照連續評估的方法對上述6個因素經行單因素試驗：在碳源添加量分別為0.40、0.60、0.80、1.00和 1.20 g/L，氮源添加量分別為3.00、5.00、7.00、9.00和11.00 g/L，pH分別為4、5、6、7、8和9，接種量分別為1%、3%、5%、7%、9%、11%，發酵時間分別在24、36、48、60和72 h，發酵溫度分別在27、32、37、42、47和52 ℃的條件下，進行各因素對發酵黃芪多糖的影響試驗。

1.3.8 發酵黃芪多糖的優化試驗設計 根據單因素試驗結果，以發酵黃芪多糖質量分數為響應值，選取pH(6、7、8)，接種量(7%、9%和11%)，時間(24、36和48h)和溫度(32、37和42 ℃)4個因素進行4因素3水平的BOX-Benken試驗設計(表4)，進行發酵黃芪多糖的條件優化。

根據表5設計的各因素水平和試驗值，運用Design Expert 8.0軟件產生21個相關試驗，每組重復3次。運用RSM軟件對試驗數據進行回歸分析，根據公式擬合出非線性二次式模型

表4 響應面實驗設計中的各因素水平及實驗值Table 4 Independent variables and the experimerental value used in the reponse surface design

其中β0、βi、βii和βij分別表示常數、先行系數、二項系數和交互項回歸系數，Xi和Xj表示獨立變量。對模型進行方差分析(ANOVA)，P值和F值檢驗。

1.3.9 數據分析 數據以“平均值(Mean)±標準差(SD)”表示。采用SPSS 17.0軟件中一維方差分析(one-way ANOVA)進行差異顯著性 分析。

2 結果與分析

2.1 篩選提高發酵黃芪多糖質量分數的工藝變量

2.1.1 PB模型設計 PB設計見表5，共11個變量，包括葡萄糖、蛋白胨、NaCl、酵母提取物、、黃芪粉、KH2PO4、溫度、pH、時間和接種量。通過12次PB設計試驗，粗多糖為評價的中心指標。各變量對多糖產量的主要影響估計為高水平(+1)和低水平(-1)。PB模型方差分析結果見表6。

P值為0.001 6，說明模型顯著。模型F-值為86.76，說明該模型具有顯著性。曲率F-值為 1.78，說明響應值相對于曲率不顯著。P值小于0.05的因素對響應面有顯著影響,并進一步選擇其進行優化研究。

表5 以多糖為響應的PB變量設計Table 5 PB variable design with polysaccharide as the response

表6 PB模型方差分析Table 6 PB model variance analysis

注：*表示差異顯著(P<0.05)；**表示差異極顯著(P<0.01)。

Note:* means significant difference(P<0.05);** means extremely significant difference(P<0.01).

2.1.2 相關因素的篩選 在11個被測變量中葡萄糖、蛋白胨、pH、時間、接種量、溫度、乳清粉、KH2PO4、NaCl、黃芪粉和酵母提取物對應A、B、C、D、E、F、G 、H、I、J和K，其中 A、B、C、D、E和F 顯著。乳清粉、KH2PO4、NaCl和酵母提取物對發酵黃芪多糖產生具有負作用，而葡萄糖、蛋白胨、pH、和時間對黃芪多糖的產生有正作用。對黃芪多糖的測定中不顯著影響因素為G、H、I，對應乳清粉、KH2PO4、NaCl，均被剔除。為了進一步優化，選擇葡萄糖、蛋白胨、pH、時間、接種量和溫度進行單因素試驗。

2.1 3 單因素試驗結果 圖1-A為葡萄糖對發酵黃芪多糖的影響，隨著葡萄糖添加量增大，黃芪多糖質量分數逐漸增大，在0.80 g/L的時候，多糖質量分數達到最大值，在初始階段，葡萄糖添加量增大，細菌增殖明顯，對黃芪木質素分解較快，多糖質量分數增高，但隨著葡萄糖添加量進一步增大，多糖質量分數明顯降低，后期達到穩定狀態；圖1-B為蛋白胨對發酵黃芪多糖的影響，蛋白胨添加量在9.00 g/L的時候，多糖質量分數達到最大值，隨著添加量增大，多糖質量分數逐漸降低。圖1-C為pH對發酵黃芪多糖的影響，有圖可知pH為7的時候，多糖質量分數達到最大值，pH逐漸加大時，有堿性增大對細菌的增殖有一定影響，多糖質量分數逐漸降低[16]。圖1-D為發酵時間對黃芪多糖的影響，在36 h 達到最大，隨后依次降低，細菌增殖過程中會消耗發酵產生的多糖；圖1-E 溫度對發酵黃芪的影響，27～ 37 ℃多糖質量分數依次增高，但是溫度越高對細菌增殖影響越大，進而多糖質量分數降低。圖1-F為細菌接種量對發酵黃芪的影響，在9%時多糖質量分數達到最大，在一定體積的發酵培養基中接菌量增大，影響細菌的繁殖，代謝廢物增多影響多糖的質量分數[17]。由于葡萄糖和蛋白胨是基礎發酵培養必須因素，對多糖質量分數測定影響較大，所以在BBD模型中刪除，以pH、時間、溫度和接種量及A、B、C和D 4個因素進行響應面優化設計。

圖1 單因素試驗Fig.1 Single factor test

2.2 響應面優化發酵黃芪多糖

2.2.1 擬合模型和數據分析 通過對RSM的中心復合設計，進行24個試驗得到時間、pH、接種量和溫度的最佳組合。表7顯示BBD矩陣以及不同變量組合的響應值。通過對數據的統計分析，得到如下回歸方程。

Y=6.96+0.21A+0.42B+0.35C+ 0.15D-0.32AB-0.25AC-0.047AD- 0.28BC-0.029BD+0.093CD- 0.30A2- 0.36B2-0.30C2-0.23D2

Y為粗多糖質量分數(%)，A、B、C、D分別為發酵pH、發酵時間、發酵溫度和接種量的編 碼值。

表7 設計模型和發酵黃芪多糖質量分數的試驗值及預測值Table 7 Experimental design model and experimental and predicted values of fermented astragalus polysaccharide content

表8 回歸方差分析Table 8 Regression analysis of variance

2.2.2 各因素間的交互作用對多糖質量分數影響 圖2反映不同兩因素交互作用的相應面，其中曲面越大代表二者交互作用越大[18]，通過二次多項回歸擬合方程得到最優條件：pH為7.35、發酵時間為37.54 h、發酵溫度為37.45 ℃、接種量10.60%，預測黃芪發酵多糖最大質量分數為 71.77%。

圖2 不同兩因素交互作用相應面Fig.2 Corresponding surface of interaction between different two factors

2.3 模型驗證

在pH為7.35、發酵時間為37.54 h、發酵溫度為37.45 ℃和接種量10.60%的優化條件下，黃芪多糖質量分數理論值可達71.77%。為了驗證響應面所得的最佳發酵工藝的可實施性，在實際試驗條件下，以pH 7、發酵時間36 h、發酵溫度37 ℃、接種量10%為最佳發酵工藝，分別進行3組平行試驗，所得黃芪多糖質量分數為(69.3± 0.013)%，結果與預測值基本相符，證明該理論 有效。

3 討 論

微生物發酵可利用中藥部分成分或培養基為營養進行分裂、生長、繁殖和代謝，在生長代謝過程中分泌大量的蛋白酶、纖維素酶、半纖維素酶、淀粉酶、果膠酶等胞外酶，可使植物細胞破裂，細胞間隙增大，加快中藥有效成分的溶出，有效提高中藥有效成分的提取率[19]。 在優化發酵工藝參數中提取物質量分數為主要研究瓶頸。試驗設計包括對數據進行統計分析，評價所選參數的交互作用效果，選擇最優工藝條件。多糖質量分數的關鍵特征是設計統計試驗、分析二次模型方程和評價顯著性水平[20-22]。Berhe等[23]采用CCD法和RSM法對中藥黃芪多糖生產的最佳條件進行評價，通過RSM方法對黃芪多糖生產優化，與經典的優化方法相比，提高多糖的質量分數。因此，本研究采用PB和RSM方法評估化學因素(葡萄糖、蛋白胨、酵母提取物、乳清粉、KH2PO4、NaCl和黃芪粉)，物理因素(溫度、pH和時間)和生物因素(接種量)等變量的綜合效應。試驗中，葡萄糖、蛋白胨、pH和時間對發酵黃芪多糖的產生有正作用，采用統計試驗設計RSM篩選變量，確定發酵培養基中所使用組分的確切數量。Xueyong Ren等[24]采用響應面法(RSM)研究蟬擬青霉固態發酵生產多糖(PCPS)的培養條件，以Plackett Burman design (PBD)對影響最大響應的因素進行篩選，然后沿著最陡的上升路徑移動到最近的響應最大區域，進行Box-Behnken設計(BBD)，優化培養條件的最終水平，在優化條件下，PCPS的最大預測產量為10.76 mg/g。Singh K等[25]從海洋芽胞桿菌中提取纖維素酶時，通過用RSM法優化其培養基組分(木糖、牛肉提取物、pH、氯化鈉和溫度)。通過回歸模型，可以分別得到任意兩個因素以及其交叉作用發酵黃芪多糖質量分數的響應面圖。交互項AB和BC影響顯著，而AD和BD均不顯著，可能是測定還原糖時其他糖類影響，進而影響多糖的質量分數。

本試驗采用Design Expert 8.0軟件，通過PB模型篩選、單因素試驗和BBD響應面優化，對葡萄糖、蛋白胨、酵母提取物、乳清粉、KH2PO4、NaCl、黃芪粉、溫度、pH、時間和接種量11個因素篩選和優化，各因素對發酵黃芪多糖質量分數變化的貢獻大小依次為時間>溫度>pH>接種量，其中時間和溫度交互作用最為明顯。最佳發酵工藝如下：時間為36 h、溫度為37 ℃、pH為7、接種量為10%，多糖質量分數為(69.3±0.013)%。因此，利用多因素篩選優化發酵黃芪使得多糖質量分數更高。