利用UPLC-MS/MS研究高Amadori化合物番茄粉的制備工藝

張淑琴， 余佳浩， 張連富

（江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

Amadori化合物是美拉德反應(yīng)的前期產(chǎn)物。果蔬原料中的葡萄糖、果糖等還原糖物質(zhì)作為羰基供體，與氨基酸、肽、蛋白質(zhì)中含有的自由氨基之間發(fā)生羰胺縮合反應(yīng)，經(jīng)Amadori重排后，形成結(jié)構(gòu)、性質(zhì)相對穩(wěn)定的關(guān)鍵中間產(chǎn)物——1-氨基-1-脫氧-2-酮糖，即Amadori化合物組分，也稱為酮糖胺組分（Ketosamines），其通用組成式為 Fructose-Amino acid[1]。在果蔬加工或儲藏過程中，ACs的檢測能夠?yàn)楣叩钠焚|(zhì)變化提供一定的技術(shù)指標(biāo)。除此以外，一些Amadori化合物已被證實(shí)具有特定的生理功效[2-10]。由于食品，尤其是富含還原糖和氨基酸的食品，在熱加工過程中很容易發(fā)生美拉德反應(yīng)生成Amadori化合物，而Amadori化合物含量的高低又直接影響熱加工食品的生理活性，因此研究熱加工食品中Amadori化合物的含量變化具有重要意義。

目前，關(guān)于Amadori化合物的研究主要集中在不同食品中Amadori化合物含量的測定[11-14]及傳統(tǒng)加工貯藏過程中Amadori化合物含量變化的監(jiān)控上[15-17]，對于如何改進(jìn)熱處理工藝以提高Amadori化合物含量，又達(dá)到產(chǎn)品常規(guī)指標(biāo)要求的研究尚未見報道。番茄富含還原糖及氨基化合物，相比于其他水果蔬菜更容易形成Amadori化合物。因此作者選擇番茄粉作為試驗(yàn)原料，以8種Amadori化合物的含量為評價指標(biāo)，探究了水分活度、溫度、時間、組氨酸添加量、抗氧化劑添加量對Amadori化合物含量的影響，采用正交試驗(yàn)法對番茄粉熱加工工藝進(jìn)行優(yōu)化，制備出高Amadori化合物含量的番茄粉，從而為制備高生理活性的番茄制品提供了一種可能。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

谷氨酸與葡萄糖Amadori化合物（Fru-Glu）、甲硫氨酸與葡萄糖Amadori化合物（Fru-Met）、苯丙氨酸與葡萄糖Amadori化合物（Fru-Phe）、丙氨酸與葡萄糖Amadori化合物 （Fru-Ala）、纈氨酸與葡萄糖Amadori化合物 （Fru-Val）、組氨酸與葡萄糖Amadori化合物 （Fru-His）、精氨酸與葡萄糖Amadori化合物 （Fru-Arg）、異亮氨酸與葡萄糖Amadori化合物（Fru-Leu）標(biāo)準(zhǔn)對照品：作者采用化學(xué)合成法自制（其結(jié)構(gòu)經(jīng)紅外光譜、三重四級桿質(zhì)譜及核磁共振表征，純度均大于98%）；試驗(yàn)用水：Mili-Q超純水；甲醇、甲酸：美國TEDIA公司產(chǎn)品；番茄粉：實(shí)驗(yàn)室自制；C18固相萃取小柱：美國SEPAX公司產(chǎn)品；UPLC-TQD超高效液相色譜-三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜：美國 Waters公司產(chǎn)品；Masslynx 4.1工作站；電子天平：梅特勒-托利多儀器上海有限公司產(chǎn)品；FZ102型微型植物粉碎機(jī)：上海巖征生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 番茄粉中Amadori化合物檢測方法建立

1.2.1 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置精確稱取8種Amadori化合物，超純水溶解，定容于50 mL容量瓶中，得到標(biāo)準(zhǔn)儲備液。取標(biāo)準(zhǔn)儲備液適量并用超純水稀釋定容，按表1配置6種不同質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

表1 標(biāo)準(zhǔn)工作液質(zhì)量濃度范圍Table 1 Concentrations of standards mg/L

1.2.2 UPLC-MS/MS條件液相條件：ACQUITY C18柱。A相：甲醇；B相：體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸水；流量：0.3 mL/min；柱溫：35 ℃；梯度洗脫程序：初始條件為B相100%，1 min到5 min內(nèi)B相由100%變?yōu)?0%，5 min到6 min內(nèi)B相由90%變?yōu)?0%，6 min到7 min內(nèi)B相由50%變?yōu)?00%，7 min之后B相保持100%，總運(yùn)行時間13 min。進(jìn)樣體積：1 μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（ESI），正離子電離模式（ESI+），多反應(yīng)檢測模式（MRM），離子源溫度：120℃；脫溶劑氣溫度：400℃；毛細(xì)管電壓：2.5 kV；脫溶劑氣流量：600 L/h；錐孔電壓：30 V；錐孔氣流量：50 L/h；碰撞能量：20 V；質(zhì)量范圍：m/z100～1 000；檢測電壓：1 600 V；高純氮?dú)猓?9.999%）。

1.2.3 樣品的預(yù)處理準(zhǔn)確稱取4.000 0 g番茄粉于150 ml錐形瓶中，加入5 mL質(zhì)量濃度為1 mg/L的咖啡因作為內(nèi)標(biāo)，同時加入45 mL超純水，高速震蕩30 s，在功率100 W的條件下超聲萃取10 min，10 000 r/min冷凍離心10 min，取上清液過C18固相萃取小柱，凈化后的液體用0.22 μm的濾膜，進(jìn)行UPLC-MS/MS分析。

1.2.4 提取條件的選擇準(zhǔn)去稱取4.000 0 g番茄粉于150 mL錐形瓶中，加入5 mL質(zhì)量濃度為1 mg/L的咖啡因作為內(nèi)標(biāo)，同時加入50 mL超純水，高速震蕩30 s，研究提取溶劑（水、甲醇、乙醇）和提取時間對8種Amadori化合物提取得率的影響。

1.3 高Amadori化合物番茄粉熱處理?xiàng)l件優(yōu)化

1.3.1 熱處理單因素試驗(yàn)準(zhǔn)確稱取10.000 0 g番茄粉于真空包裝袋中，真空密封，置于水浴鍋中進(jìn)行加熱處理。研究番茄粉水分活度，加熱溫度，加熱時間，氨基酸添加量及抗氧化劑添加量對8種Amadori化合物生成量的影響。以8種Amadori化合物生成量為評價指標(biāo)，確定加工工藝。

1.3.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)為優(yōu)化熱處理工藝，根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取水分活度，加熱溫度，加熱時間，氨基酸添加量及抗氧化劑添加量為實(shí)驗(yàn)因素，設(shè)計(jì)五因素四水平的正交試驗(yàn)，以8種Amadori化合物總量和Fru-His含量為指標(biāo)，并進(jìn)行極差分析，選擇最優(yōu)組合，從而確定最高Amadori化合物及Fru-His含量的番茄粉制備工藝。正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素水平見表2。

表2 正交試驗(yàn)表Table 2 Orthogonal experiments

2 結(jié)果與分析

2.1 超高效液相色譜質(zhì)譜標(biāo)準(zhǔn)品的檢測結(jié)果

2.1.1 8種Amadori化合物混合標(biāo)準(zhǔn)曲線及色譜圖將1.2.1中的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液在1.2.2的超高效液相色譜質(zhì)譜條件下檢測，圖1顯示了8種Amadori化合物的MRM色譜圖。將目標(biāo)物與內(nèi)標(biāo)峰面積之比（Y）和目標(biāo)物與內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度之比（X）進(jìn)行線性回歸分析，得到標(biāo)準(zhǔn)線性方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍，結(jié)果見表3。

圖1 8種Amadori化合物的MRM色譜圖Fig.1 Typical chromatographic profiles of eight ACs using ACQUITY C18 Column with the addition of internal standard（caffeine） under optimization LC-MS-MS conditions

表3 標(biāo)準(zhǔn)回歸方程、相關(guān)系數(shù)和質(zhì)量濃度線性范圍Table 3 Linearity and detection limit

2.1.2 回收率試驗(yàn)采用在番茄粉中加標(biāo)的方法測定Amadori化合物的回收率。表4顯示，回收率86.54%～101.87%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差1.38%～4.49%，表明該方法具有較好的再現(xiàn)性。

2.2 番茄粉中Amadori化合物提取條件優(yōu)化

2.2.1 提取溶劑對提取得率的影響根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)超聲的提取方式更加省時、高效，因此選擇超聲的提取方式，對提取溶劑進(jìn)行了篩選。試驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。從圖中可以看出水的提取效果明顯高于其他兩種溶劑。這可能是因?yàn)锳madori化合物作為一種多羥基化合物，具有很強(qiáng)的極性[18]。根據(jù)“相似相溶”原理，水的提取效果最好，甲醇次之，乙醇最差，所以選擇水為提取溶劑。

2.2.2 提取時間對提取得率的影響由圖3可知隨著提取時間的增加，Amadori化合物的得率先增大后減小。當(dāng)提取時間為10 min時，8種Amadori化合物的提取總量最大，除Fru-Met和Fru-Ala以外，其他6種Amadori化合物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為最大值。當(dāng)提取時間過長時，其他6種Amadori化合物會在超聲的作用下發(fā)生降解，質(zhì)量分?jǐn)?shù)會有明顯的降低，而上述兩種Amadori化合物的增加量不顯著，因此提取時間應(yīng)選擇10 min為宜。

續(xù)表4

圖2 提取溶劑對Amadori化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig.2 Effect of solvent on Amadori Compounds yield

圖3 提取時間對Amadori化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig.3 Effect of extraction time on Amadori Compounds yield

2.3 高Amadori化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)番茄粉熱處理工藝優(yōu)化

2.3.1 番茄粉水分活度對Amadori化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)影響由圖可知8種Amadori化合物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均隨著水分活度的增加先增大后減小，當(dāng)番茄粉的水分活度為0.34時，Amadori化合物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到最大值。這是因?yàn)榘被岷推咸烟前l(fā)生脫水反應(yīng)，經(jīng)Amadori重排生成有活性的極性小分子，是一個可逆反應(yīng)[18]。當(dāng)番茄粉的水分活度增大時，不利于脫水反應(yīng)的發(fā)生，反應(yīng)向逆方向進(jìn)行，Amadori化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低，因此較低的水分活度更有利于Amadori化合物的生成。

圖4 水分活度對Amadori化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig.4 Effect of different water activity on Amadori Compounds yield

2.3.2 溫度對番茄粉中Amadori化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響溫度是影響美拉德反應(yīng)的重要因素，由圖5可知，隨著溫度的上升，8種Amadori化合物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均有不同程度的增加，當(dāng)反應(yīng)溫度為60℃時，8種Amadori化合物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)總和達(dá)到最大值，同時其中7種Amadori化合物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均達(dá)到最大值。這可能是因?yàn)樵谝欢囟确秶鷥?nèi)，溫度的升高有利于提高番茄粉中糖和氨基酸的反應(yīng)活性，使得Amadori化合物的產(chǎn)量逐漸上升。當(dāng)反應(yīng)溫度高于60℃時，盡管Fru-Ala的質(zhì)量分?jǐn)?shù)有微量上升，但其它7種Amadori化合物含量均有顯著降低。Amadori化合物作為美拉德反應(yīng)的前期產(chǎn)物，它的形成和降解是同時發(fā)生的，在溫度較高的條件下，Amadori化合物的降解速率大于生成速率，會進(jìn)一步反應(yīng)生成類黑素等后期產(chǎn)物。故反應(yīng)溫度選擇60℃為宜。

圖5 溫度對Amadori化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig.5 Effectofdifferenttemperatureon Amadori Compounds yield

2.3.3 時間對番茄粉中Amadori化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響從圖6可以看出隨著加熱時間的增大，Amadori化合物的含量有一個明顯上升的過程，當(dāng)加熱時間超過4 h時，8種Amadori化合物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均有明顯下降，尤其是Fru-Glu和Fru-His的含量顯著降低。這可能是因?yàn)殡S著加熱時間的增加，Amadori化合物繼續(xù)參與反應(yīng)生成類黑素等晚期糖基化產(chǎn)物。故番茄粉的加熱時間應(yīng)選擇4 h。

圖6 時間對Amadori化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig.6 Effect of different heating time on Amadori Compounds yield

2.3.4 組氨酸添加量對番茄粉中Amadori化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fru-Glu和Fru-His可以有效抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）的活性[6]。目前，常用抑制ACE的活性來治療高血壓。由試驗(yàn)可知Fru-Glu是番茄粉中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高的Amadori化合物，而Fru-His含量較低，因此選擇外源添加組氨酸的方法來提高番茄粉中Fru-His的含量，從而提高番茄粉的生物活性。由圖7可知，隨著組氨酸添加量的不斷增加，F(xiàn)ru-His的含量逐漸上升。當(dāng)組氨酸的添加量為4 mg/g時，8種Amadori化合物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到最大值；當(dāng)組氨酸的添加量大于4 mg/g時，其他7種Amadori化合物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均有明顯的降低。這可能是因?yàn)榻M氨酸的反應(yīng)活性較高，優(yōu)先與葡萄糖發(fā)生反應(yīng)，從而使得其他7種氨基酸與葡萄糖發(fā)生反應(yīng)的速率下降。因此組氨酸的添加量為4 mg/g。

圖7 組氨酸添加量對Amadori化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig.7 Effect ofL-Histidine on Amadori Compounds yield

2.3.5 抗氧化劑添加量對番茄粉中Amadori化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響通過預(yù)實(shí)驗(yàn)，選擇茶多酚作為抗氧化劑來抑制美拉德后期反應(yīng)的發(fā)生。由圖8可知，當(dāng)抗氧化劑的添加量在0～0.06 mg/g時，8種Amadori化合物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均隨著抗氧化劑的增加而增加。這可能是因?yàn)椴瓒喾幽軌蚯宄览路磻?yīng)中產(chǎn)生的自由基，從而抑制美拉德后期褐色產(chǎn)物的生成，促進(jìn)前期Amadori化合物的生成[19]。當(dāng)抗氧化劑的添加量大于0.06 mg/g時，8種Amadori化合物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨著抗氧化劑的增加而明顯降低，尤其是Fru-Glu和Fru-His的質(zhì)量分?jǐn)?shù)明顯降低。這是因?yàn)椴瓒喾拥幕瘜W(xué)結(jié)構(gòu)使其可能會參與美拉德后期產(chǎn)物的形成，當(dāng)抗氧化劑的質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過一定范圍時，反而有利于美拉德后期產(chǎn)物的生成，從而減少Amadori化合物的形成。故抗氧化劑的添加量應(yīng)選擇0.06 mg/g為宜。

2.3.6 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析根據(jù)單因素結(jié)果，在正交試驗(yàn)中，考慮到Fru-His的高生理活性，故以8種Amadori化合物總質(zhì)量分?jǐn)?shù)和Fru-His質(zhì)量分?jǐn)?shù)為評價指標(biāo)，考察了各因素對Amadori化合物總質(zhì)量分?jǐn)?shù)和Fru-His質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響情況。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表5所示。

圖8 抗氧化劑添加量對Amadori化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig.8 Effect of antioxidants on Amadori Compounds yield

采用綜合平衡分析法對結(jié)果進(jìn)行分析。比較表中的極差R值可知，對Amadori化合物總量影響因素主次是E＞B＞C＞A＞D，即關(guān)鍵影響因素為抗氧化劑添加量、溫度和時間，其他為次要因素，由K值大小可知因素最優(yōu)水平組合為B1C3E1；對Fru-His含量影響因素主次是E＞A＞C＞B＞D，即關(guān)鍵影響因素為抗氧化劑添加量、水分活度，由K值大小可知因素最優(yōu)的水平組合為A4E1。因此較優(yōu)熱處理工藝為A4B1C3E1，由于Amadori化合物總質(zhì)量分?jǐn)?shù)為相對重要的指標(biāo)，故因素D選擇D1。綜上所述分析，最佳的生產(chǎn)工藝應(yīng)為A4B1C3D1E1，即抗氧化劑添加量為0.048 mg/g，反應(yīng)溫度為54℃，反應(yīng)時間為4.2 h，水分活度為0.44，組氨酸添加量為2.8 mg/g。

表5 正交試驗(yàn)表及結(jié)果Table 5 Design and the results of the orthogonal experiments

2.3.7 驗(yàn)證試驗(yàn)按照A4B1C3D1E1條件進(jìn)行3次放大平行試驗(yàn)，總Amadori化合物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均值為152.59 mg/g，F(xiàn)ru-His質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 3.32 mg/g，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均有提高，證明工藝有效。

3 結(jié) 語

在利用UPLC-MS/MS方法檢測果蔬制品中Amadori化合物含量的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步優(yōu)化了番茄粉的前處理提取條件，研究結(jié)果顯示以水為提取溶劑，超聲提取10 min時，Amadori化合物的提取得率最高。同時探討了高Amadori化合物番茄粉的制備工藝，以8種Amadori化合物總質(zhì)量分?jǐn)?shù)及Fru-His的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為評價標(biāo)準(zhǔn)，通過單因素及正交試驗(yàn)分析了影響番茄粉中8種Amadori化合物生成量的因素，進(jìn)而得到了最佳的熱處理工藝：抗氧化劑添加量0.048 mg/g，反應(yīng)溫度54℃，反應(yīng)時間4.2 h，水分活度0.44，組氨酸添加量2.8 mg/g。在此條件下，總Amadori化合物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為152.59 mg/g，F(xiàn)ru-His質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.32 mg/g。該方法為制備富含Amadori化合物的番茄粉奠定了基礎(chǔ)。