新雜合抗結核藥物的合成及抗菌活性

祝 宏，曾祥聰，丁 嬌，李 麗 ，馬 俊，張 煥 ，劉 慧*

1.武漢工程大學化工與制藥學院，湖北 武漢 430205；2.武漢市金銀潭醫院，湖北 武漢 430023

結核病是一種傳染性強、難治愈、發病率、致死率高的的疾病，而中國是感染人群最多且死亡率較高的國家［1］。結核桿菌是結核病的病原體，可攻擊人的組織及器官，近年來藥物的使用頻繁，導致耐藥結核桿菌及耐多藥結核桿菌的產生［2］，為滿足臨床的需求，需要采取措施來預防和抗結核藥物的創新。在新藥研究與開發上，雜合物越來越受重視，對其的研究和開發也越來越多，通過化學反應將不同的連接基團的兩個分子連接起來合成雜合藥物，形成的藥物或具有兩者的性質。分子中的兩類藥物的藥效部位各自與不同的靶標結合，多靶點給藥，減緩耐藥性速率［3］；強化藥理作用，減弱相應的毒副作用；或發揮各自的藥理活性，協同完成治療效用［4］，發揮藥物的最大藥效，降低藥物的耐藥率，延遲耐藥的周期。

水楊酸類藥物是應用最早，最廣和最普通解熱鎮痛藥，Ratnasinghe等［5］在調查研究中發現，服用阿司匹林可以降低肺癌的死亡率。異煙肼是一種全能殺菌藥，乙胺丁醇是人工合成的一種阿拉伯糖類抗結核藥，兩者均用于臨床是治療結核病的重要一線藥物，具有殺菌力強、選擇性高、副作用少的優點。雜合反應在藥物合成中有著廣泛的應用，在雜合藥物的制備過程中，酰化反應在治療結核病領域有著重要作用。通過成酯、成酰胺等修飾可以改變原來藥物的理化性質、降低毒副作用、改善藥物的體內代謝、提高療效等來減弱藥物的耐藥性［6-8］。在蛋白質中酰胺鍵是關鍵的化學鍵，也是合成其他高分子材料的基礎結構，具有極性大、穩定性好和結構多樣性等性質，成為有機化學分支中最普遍和應用最廣的官能團之一，但很多簡單的酰胺其實是很難合成的［9-11］。根據以上分子設計原理，本文合成了兩種抗結核類衍生物（見圖1），這類化合物的抗結核桿菌研究還是較新的領域，有巨大潛在的研究意義。

圖1 乙酰水楊酸、異煙肼和乙胺丁醇的化學結構Fig.1 Structures of acetylsalicylic acid，isoniazid and ethambutol

乙酰水楊直接與異煙肼及乙胺丁醇反應活性很低，產物的收率也很低，需要對反應過程進行改進。根據乙酰水楊酸的化學結構上有裸露的羧基，碳原子部分會顯正電性，羧酸是弱的酰化基，在反應過程中需要加入催化劑使羧酸形成活性中間體，增強反應活性。異煙肼分子結構中的肼基，有比較強的親核能力，容易進行酸胺縮合反應。乙酰水楊酸和異煙肼進行酸胺縮合反應，在反應的過程加入二環已基碳二亞胺，與乙酰水楊酸形成活性酰胺，發生親核取代反應得到目標產物。實驗過程加入催化量的催化劑p-二甲氨基吡啶［12］和DCC上有孤對電子進攻羰基C，獲得氫后離去得酰胺產物9；進攻羥基氫生成過渡態，經質子作用脫水，再脫去質子得到酰化產物13（見圖2和圖3）。

圖2 乙酰水楊酸-異煙肼的合成路線Fig.2 Synthesis route of acetylsalicylic acid-isoniazid

1 實驗部分

1.1 儀器的廠家

異煙肼（天津市博迪化工有限公司）；乙胺丁醇（宜昌人福藥業有限責任公司）；其余反應所用的試劑均為分析純，并按要求進行純化處理。

DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌；AB204-N型電子天平；ZF 7三用紫外分析儀；旋轉蒸發器RE-52C；Mercury Plus 400超導核磁共振儀；Nicolet5700型傅里葉紅外光譜儀，KBr壓片；UltiMate3000戴安高效液相色譜儀；Thdermo Trace GC ULTRA DSQ II型氣質連用儀；Agilent 6460 LC/MS液質聯用儀。

圖3 乙酰水楊酸-乙胺丁醇的合成路線Fig.3 Synthesis route of acetylsalicylic acid-ethambutol

1.2 試驗方法

1.2.1 目標化合物9和13的合成 稱取0.66 g（3.66 mmol）乙酰水楊酸以及 0.50 g異煙肼（3.64 mmol）溶于15mLN，N-二甲基甲酰胺中，在30℃條件下磁力攪拌，加入0.75 g除水劑二環己基碳二亞胺和0.02 g催化劑4-二甲氨基吡啶（異煙肼質量的5%～10%），溶液變成黃色，保溫反應12h，用薄層層析硅膠板跟蹤反應，待反應結束后，過濾。將濾液緩慢滴加至120mL冰水中，邊加邊攪拌，將得到的混合液再次抽濾，濾餅用冰水洗滌1～3次，再用飽和NaCl溶液洗滌1次，最后將濾餅轉入真空干燥器中充分干燥，得到目標產物淡黃色化合物9。分析計算可知，產品收率為87.50%。

乙酰水楊酸-異煙肼（9）：淡黃色固體；m.p.115 ～120；IR（ KBr，cm－1）：3248.82，2857.15，1675.95，1659.45，1501.37，1620.42，11449.13，1130.34，951.78，751.29 ；1 H NMR（400 MHz，CDCl3），δ：6.90（m，1H），7.03（m，1H），7.27（m，1H），7.10（s，1H），2.93（d，1H），2.93（d，1H），2.31（d，3H），2.55（m，1H），2.93（d，1H），2.93（d，1H），3.16（dd，1H）；HRMS-ESI（m/z）calculated for［M+H+］：299.09，found：299.89。

稱取0.44 g（2.44 mmol）乙酰水楊酸和 0.50 g（2.45 mmol）乙胺丁醇溶于15mL二甲亞砜中，在30℃條件下磁力攪拌，加入0.50 g除水劑二環己基碳二亞胺和0.03 g催化劑4-二甲氨基吡啶（乙胺丁醇質量的5%～10%），溶液變成白色，保溫反應12h，用薄層層析硅膠板跟蹤反應，待反應結束后，過濾。待反應結束后，過濾，將濾液緩慢滴加至120mL水中，邊加邊攪拌，將得到的混合液用二氯甲烷反復萃取3次，萃取所得有機相依次用水、飽和NaCl溶液各洗滌1次，向洗滌后的有機相中加入無水硫酸鈉進行干燥，靜置0.5h后旋干，得到目標產物白色化合物13。分析計算可知，產品收率為86.35%。

乙酰水楊酸-乙胺丁醇（13）：白色固體；m.p.120～125；IR（ KBr，cm-1）：3342.36，2926.48，1733.69，1606.30，1102.36，1047.68，757.59；1 H NMR（400 MHz，CDCl3），δ：6.91（m，1H），7.04（s，1H），9.45（m，1H），7.25（m，1H），7.43（d，1H），2.32（s，3H），4.27（s，2H），3.4（m，1H），1.34（s，2H），1.02（s，3H），1.91（d，1H），2.15（m，2H），2.15（m，2H），1.91（d，1H），2.34（s，1H），2.32（d，2H），0.73（s，3H），3.47（d，2H），1.91（d，1H）；HRMS-ESI（m/z）calculated for［M+H+］：366.22；found：405.22。

2 生物活性測試

2.1 測試方法

抑菌活性試驗用抗結核藥物的7H9培養基，由武漢市金銀潭醫院提供。化學試劑二甲基亞砜、質量分數10%的Tween-80、甲醇、去離子水為分析純，購自國藥化學試劑有限公司。用不含抗結核藥物的7H9培養基作空白對照。采用微孔顯色法及盲法編排測試。

稱取乙酰水楊酸、異煙肼、乙胺丁醇、乙酰水楊酸-異煙肼和乙酰水楊酸-乙胺丁醇各50 mg，用去離子水分別溶解，再轉移至50mL的容量瓶用去離子水定容，分別配成1.0 mg/mL濃度的藥液，以0.5 mg/mL為進行實驗測試的最大濃度，濃度依次往下做對倍稀釋。

2.2 測試結果

以不加抗結核藥原液的培養基為對照組，隨著時間推移，觀察培養基的顯色情況，培養基的顯色情況反映了HR37V標準株的生長情況，進一步說明了藥物對結核桿菌的敏感性［12］。R為對結核分枝桿菌的耐藥性，即無活性；S為對結核分枝桿菌的敏感性，即為有活性（質量濃度單位為μg/mL），培養基能顯示藍色的最低濃度為藥物的最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）［13］值，結果見表 1。

表1 目標化合物的抑菌活性Tab.1 Antibacterial activity of target compounds

3 結果與討論

3.1 化合物的合成

乙酰水楊酸-異煙肼的合成，實質就是羧酸中的羥基被氨基取代而生成酰胺的反應，可以阻止和延緩異煙肼在體內的乙酰化；乙酰水楊酸-乙胺丁醇的合成，實質就是羧基和羥基生產脂的反應，并起到協同的抗菌作用，減弱藥物的耐藥率，合成抗結核桿菌且具有抗耐藥的藥物分子。更重要的是乙酰水楊酸-異煙肼和乙酰水楊酸-乙胺丁醇都可以通過“一鍋法”［14-16］反應得到，操作簡單易實施，可以利用廉價易得的試劑在溫和條件下獲得良好收益的目標產物，收率高，且該反應應用范圍廣，同時催化劑也可回收使用，潛在應用巨大。

3.2 譜圖分析

目標化合物乙酰水楊酸-異煙肼的IR圖譜（見圖4），3248.82 cm-1、3244.7 cm-1為酰胺基 N-H鍵彎曲振動吸收峰，1675.95 cm-1為 C=O的伸縮振動吸收峰。化合物乙酰水楊酸-異煙肼的1H NMR（d6-二甲基亞砜作溶劑）圖譜化學位移在δ=2.93為酰胺基NH氫吸收峰；目標化合物乙酰水楊酸-乙胺丁醇的IR圖譜（見圖5），1733.69 cm-1為酯基R-CO-OR伸縮振動吸收峰，1047.68 cm-1為-OH的吸收峰。化合物乙酰水楊酸-乙胺丁醇的1H NMR（d6-二甲基亞砜作溶劑）圖譜化學位移在δ=1.91為OH氫吸收峰，化學位移在δ=2.15為NH氫吸收峰。

圖4 乙酰水楊酸-異煙肼：（a）紅外圖譜，（b）核磁共振氫譜Fig.4 Acetylsalicylic acid-isoniazid：（a）IR spectrum，（b）1H NMR

圖5 乙酰水楊酸-乙胺丁醇：（a）紅外圖譜，（b）核磁共振氫譜Fig.5 Acetylsalicylic acid-ethambutol：（a）IR spectrum，（b）1H NMR

4 結 語

采用氧化還原指示劑顯色法來檢測結核桿菌的耐藥性，通過指示劑由氧化態轉變為還原態過程中顏色變化判斷藥物的敏感性。初篩結果顯示：目標化合物9和13顯示出較好的殺菌活性，其中13的殺菌效果相對于9而言，有更強的的殺菌效果。此外，這個反應對環境友好、條件溫和、成本低，其原理和機理可應用于藥物分子合成，催化方法給化學反應提供了新的可能，對抗結核藥物及抗耐藥性的衍生物的設計和合成具有一定的意義。