不同基因型玉米自交系拔節期與抽雄期干旱脅迫的生理響應機制

魯曉民 張軍 曹麗茹 張前進 魏昕 王振華 張新

摘要：為研究不同生長發育階段中度干旱脅迫下不同基因型玉米自交系的生理響應機制，篩選抗旱種質資源，通過可控移動旱棚對拔節期和抽雄期9份玉米自交系進行中度干旱脅迫，測定相對含水量（RWC）、葉綠素（Chl）、類胡蘿卜素（Car）、脯氨酸（Pro）含量及超氧化物歧化酶（SOD）、抗氧化物酶（POD）活性等生理指標的變化，采用熱圖和隸屬函數平均值（AVG）分析不同基因型自交系各個生理指標的響應程度并進行抗旱性歸類。結果表明，旱脅迫下，與對照相比，拔節期和抽雄期玉米自交系的葉片RWC、Chl和Car含量均有不同程度的下降，Pro含量及SOD、POD活性均不同程度的提高;在拔節期，鄭6613、鄭718、吉853、鄭6722、鄭7413、鄭754歸于抗旱型自交系，鄭663歸為中抗型自交系，B73和自交系DH351歸為敏感型自交系;在抽雄期，鄭6613、吉853、鄭6722、自交系鄭663歸于抗旱型自交系，DH351、鄭718、鄭7413、鄭754歸為中抗型自交系，B73歸為敏感型自交系。其中鄭6613、吉853和鄭6722在2個生育期均表現為較強的抗旱性，這些種質的應用對今后的抗旱育種及應對黃淮海高溫干旱天氣有著重要的現實意義。

關鍵詞：玉米;中度干旱脅迫;生理指標;熱圖;平均隸屬函數

中圖分類號： S513.034 ?文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）16-0097-06

收稿日期：2018-05-04

基金項目：河南省農業科學院科研發展專項資金（編號：YNK201710603）;河南省重大科技專項（編號：151100111000-02）;河南省基礎前沿項目（編號：162300410139）。

作者簡介：魯曉民（1980—），男，河南許昌人，博士，副研究員，主要從事玉米遺傳育種研究。

通信作者：張 新，研究員，主要從事玉米遺傳育種研究。

干旱是限制作物產量重要的非生物脅迫因素之一。玉米是高光喜水作物，整個生育期都需要大量的水分，對干旱比較敏感，尤其是苗期、拔節期、抽雄散粉期和灌漿期。近年來，黃淮海自然災害天氣頻發，在玉米生長的關鍵時期經常出現長時間的高溫干旱天氣，并對玉米產量造成了嚴重的損失。研究表明，不同基因型玉米自交系對干旱脅迫的敏感程度不同，耐旱型的受旱脅迫影響較小，因此篩選鑒定耐旱種質并培育耐旱品種是解決干旱脅迫、降低產量損失的必然途徑。

干旱脅迫影響植物的生理和生化過程，脅迫下作物正常的水分平衡被打破，水勢降低，并導致水分代謝途徑發生改變，進而影響作物的生長發育，最終產量降低或無產量;同時植物可通過誘導各種形態和生理反應來響應和適應干旱脅迫[1-3]。參與旱脅迫有多個過程，如滲透調節物和抗氧化酶、植物生長調節劑、脅迫蛋白和水通道蛋白、轉錄因子的積累和信號傳導途徑。

抗氧化反應是參與旱脅迫最終的反應之一，旱脅迫下作物體內包括葉綠體、線粒體、過氧化物酶體等都能產生大量的活性氧（ROS），從而對細胞造成嚴重的傷害，導致代謝紊亂[4]。為了應對ROS造成的傷害，作物通過自身的抗氧化機制來抵抗旱脅迫，如通過提高超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）等的活性，還有一些小分子抗氧化劑（如類胡蘿卜素、多酚、花青素等）和一些滲透劑（如蛋白質和糖等）來清除過量的ROS[5-7]。

另外，旱脅迫下作物自身亦可通過合成不同的滲透劑，通過在缺水條件下維持細胞膨脹和其他的生理機制來保護細胞結構和功能以及保持水平衡并延遲脫水損傷，從而維持水分平衡，降低細胞滲透勢被破壞的程度，并且滲透調節劑可以進一步改善作物生殖期的碳水化合物分配，并最終提高產量[8-9]。脯氨酸是一種強滲透調節物，旱脅迫下作物體內游離脯氨酸迅速成倍的積累，不僅有助于維持細胞膨脹，而且還參與猝滅自由基，維持亞細胞結構和緩沖細胞氧化還原電位[10]，顯著提高作物的耐旱性。

本研究利用可控移動旱棚對9份國內玉米骨干系及自選系在拔節期和抽雄期進行中度旱脅迫，通過對自交系葉片RWC、SOD、POD、Pro、Chl和Car等生理指標的測定，利用熱圖分析不同基因型自交系的耐旱性及每個生理指標的響應程度;采用隸屬函數平均值（AVG）進行不同基因型自交系抗旱性鑒定，以期篩選出在拔節期和抽雄期抗旱性強的自交系，為今后的玉米抗旱育種提供種質基礎及理論指導。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及種植方式

2017年在河南省農業科學院原陽基地可控移動旱棚內種植9份國內玉米骨干系及自選系（名稱及編號見表1），每份材料種植1行，每行16株，行長4.0 m，行距0.6 m，株距 0.25 m。設對照和干旱（拔節期和抽雄期）3個處理，處理間設以3 m水分隔離帶。對照土壤田間最大持水量持續保持在75%以上，拔節期和抽雄期前分別對干旱處理進行5 d的水量控制，保持田間最大持水量在40%左右，而后進行15 d的干旱脅迫。

1.2 試驗方法

1.2.1 生理指標測定

拔節期取樣部位為倒數第2葉，抽雄期取樣部位為穗位葉，主要測定相對含水量（RWC）、葉綠素（Chl）、類胡蘿卜素（Car）、 游離脯氨酸（Pro）含量及超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）活性。Chl和Car含量采用丙酮法測定[11];SOD活性采用氮藍四唑法測定、POD活性采用愈創木酚法測定[12];RWC采用烘干法測定;Pro積累量采用磺基水楊酸提取-茚三酮法測定[13]。

1.2.2 抗旱性評價

抗旱系數=干旱脅迫下性狀值/對照性狀值。隸屬函數值U（X）=（X-a1）/（a2-a1），式中：X為某一指標的抗旱系數;a1、a2分別為所有材料某一指標的最小和最大抗旱系數。根據抗旱隸屬函數的平均值分為4級：U（X）≥0.7屬于1級，強抗旱型;0.5≤U（X）<0.7屬于2級，抗旱型;0.4≤U（X）<0.5屬于3級，中抗旱型;0≤U（X）<0.4屬于4級，弱抗旱型。

1.3 數據處理與分析

試驗數據以3次重復的“平均值±標準偏差”表示，并利用SPSS 16.0統計軟件進行方差分析，采用Duncans新復極差法進行差異顯著性分析和多重比較，并使用SigmaPlot 12.5和R語言3.4軟件進行作圖。

2 結果與分析

2.1 旱脅迫對拔節期和抽雄期不同基因型玉米自交系生理生化指標的影響

2.1.1 旱脅迫對拔節期和抽雄期不同基因型玉米自交系相對水含量（RWC）的影響

由圖1可知，旱脅迫下，與正常水分條件相比，不同基因型玉米自交系在拔節期和抽雄期RWC顯著或極顯著下降，且不同生育期同一自交系和同一生育期不同自交系下降幅度不同。旱脅迫下，玉米體內自由水含量急劇下降，拔節期鄭6613和抽雄期鄭718、鄭663自交系的RWC下降幅度達到顯著水平，其他自交系在2個生育期均達到極顯著水平，說明拔節期鄭6613和抽雄期鄭718、鄭663在旱脅迫下體內自由水含量受影響較小，RWC相對較高。

2.1.2 旱脅迫對拔節期和抽雄期不同基因型玉米自交系脯氨酸（Pro）含量的影響

正常水分條件下，不同基因型玉米自交系在拔節期和抽雄期的Pro含量均較低，且抽雄期明顯高于拔節期。由圖2可知，旱脅迫下，不同基因型玉米自交系在不同生育期Pro積累量均增加，尤其是拔節期鄭718、鄭6722、鄭663和抽雄期鄭6613、鄭6722等自交系Pro含量積累相對較多;除抽雄期DH351的Pro含量積累未達到顯著水平、拔節期B73達到顯著水平外，其余自交系均達到極顯著水平。研究表明，不同基因型自交系在旱脅迫下均可通過積累游離Pro的含量來緩解旱脅迫的壓力，但不同自交系及其在不同生育期時的Pro含量積累不盡相同。

2.1.3 旱脅迫對拔節期和抽雄期不同基因型玉米自交系葉綠素（Chl）含量的影響

正常水分條件下，不同基因型玉米自交系在拔節期和抽雄期的Chl含量相對較高，但存在一定的差異，可能與自交系的基因型有關。旱脅迫下，作物體內的葉綠素由于不穩定而降解，不但葉綠素含量下降，而且也損害了光合器官，光合作用下降[14]。從圖3可以看出，旱脅迫下不同基因型玉米自交系在2個生育期的Chl含量均存在不同程度的下降，其中抽雄期脅迫與對照相比，除B73和鄭718自交系在脅迫下未到達差異顯著水平外，其他自交系在抽雄期下降程度均達到顯著或極顯著水平。

2.1.4 旱脅迫對拔節期和抽雄期不同基因型玉米自交系類胡蘿卜素（Car）含量的影響

類胡蘿卜素是一種輔助色素，可以吸收可見光來輔助葉綠素捕獲光能。不同自交系自身所含Car含量不同，正常情況下，不同基因型自交系在2個生育期的Car含量略高，旱脅迫時，Car含量有所下降，但不同自交系、不同生育期下降的幅度不同，可能與基因型和生長發育階段所需有關。由圖4可知，與對照相比，旱脅迫下自交系均不同程度下降，但不同自交系下降幅度不同，拔節期的DH351、吉853、鄭663和抽雄期的鄭6613等自交系的Car含量下降甚少。

2.1.5 旱脅迫對拔節期和抽雄期不同基因型玉米自交系過氧化物酶（POD）活性的影響

POD作為抗氧化酶之一，能夠清除ROS來維持植物正常生長，植物在遭受旱脅迫時可通過提高其活性來緩解旱壓力，從而保護細胞膜免受傷害。正常條件下，不同基因型自交系在2個生育期的葉片POD活性較低，且不同生育期、不同自交系間也不相同。由圖5可知，旱脅迫下不同生育期玉米自交系的POD活性均極顯著提高，抽雄期不同玉米自交系POD活性升高幅度比拔節期的要高很多，推測玉米自交系在抽雄期旱脅迫下，POD在緩解干旱造成的脅迫方面起著重要的作用， 其中自交系吉853和鄭7413表現得尤為明顯。

2.1.6 旱脅迫對拔節期和抽雄期不同基因型玉米自交系超氧化物歧化酶（SOD）活性的影響

應對干旱脅迫，1種抗氧化酶作用是有限的，SOD與POD一樣是重要的抗氧化酶之一，二者在旱脅迫下協同作用，清除旱脅迫下的過量ROS，維持植物體內自由基平衡。正常水分情況下，不同基因型玉米自交系葉片SOD活性較低。由圖6可知，旱脅迫下自交系SOD活性均明顯上升，且不同生育期、不同自交系活性提高幅度不同，除抽雄期鄭754自交系外，其他均達到顯著甚至極顯著水平。

2.2 旱脅迫下拔節期不同基因型玉米自交系的抗旱性綜合評價

以所測生理指標隸屬函數值進行抗旱性熱圖分析。從圖7可以看出，在拔節期旱脅迫下，自交系吉853和鄭754抗旱性接近，與對照相比所有生理指標均響應旱脅迫壓力，尤其是SOD、POD活性提高較大，脯氨酸積累較多，葉綠素含量、類胡蘿卜素含量和RWC下降較少，抗旱性較強;自交系B73和DH351抗旱性接近，與對照相比，SOD、POD活性提高較小、脯氨酸積累較少，RWC較低，屬于旱敏感型自交系。

從各生理指標的平均隸屬函數值（表2）發現，自交系鄭6613、鄭718、吉853、鄭6722、鄭7413、鄭754平均隸屬函數值在0.556～0.686之間，屬于抗旱型;自交系鄭663平均隸屬函數值為0.445，屬于中抗型;自交系B73和DH351平均隸屬函數值分別為0.399、0.330，屬于旱敏感型，與熱圖所展示的結果基本一致。

2.3 旱脅迫下抽雄期不同基因型玉米自交系的抗旱性綜合評價

從圖8可以看出，在抽雄期旱脅迫下，自交系吉853與對照相比，SOD、POD活性提高較大，脯氨酸積累量較多，且抗氧化劑類胡蘿卜素破壞較小，葉綠素含量和RWC下降較少，屬于抗旱性較強;自交系B73與對照相比，葉綠素和類胡蘿卜素破壞嚴重，含量較低，屬于旱敏感型自交系。

從各生理指標的平均隸屬函數值（表3）發現，自交系鄭6613、吉853、鄭6722、鄭663平均隸屬函數值在0.502～0.594 之間，屬于抗旱型;自交系DH351、鄭718、鄭7413、鄭754平均隸屬函數值在0.406～0.496之間，屬于中抗型，自交系B73平均隸屬函數值為0.390，屬于旱敏感型，與熱圖所展示的結果基本一致。

3 討論與結論

與其他環境脅迫一樣，旱脅迫影響作物內的許多生理和代謝過程。輕度脅迫水平（-0.4 MPa）作物不受影響，但是中度和重度脅迫下嚴重影響作物生長發育。滲透調節一直被認為是耐旱性的重要部分，玉米通過不同滲透物質的積累來維持細胞膨壓和保護細胞結構，以此來提高耐旱性，目前與滲透相關的耐旱生理指標有滲透勢、可溶性糖和脯氨酸等[15]。Ghaderi等的研究發現，中度和重度旱脅迫影響作物體內脯氨酸的生物合成和積累及可溶性碳水化合物含量[16]。PEG誘導水分脅迫下，一些相容的溶質如脯氨酸和其他游離氨基酸的積累量顯著增加以調節滲透壓、維持pH值、保護細胞內大分子物質并且清除有害自由基[17]。強滲透調節劑脯氨酸在作物中可以穩定膜并在低葉水勢下維持蛋白質的結構，不同作物及相同作物的不同品種間脯氨酸的合成和積累是不同的。有研究報道，脯氨酸通過清除或減少O2的產生而參與減少類囊體膜中的光損傷[18]。本研究旱脅迫下2個生育期的不同基因型自交系均不同程度的積累脯氨酸，尤其是拔節期鄭718、鄭6722、鄭663和抽雄期的鄭6613、鄭6722自交系，脯氨酸積累較多，與前人抗旱性研究結果[19-21]基本一致。

葉綠素是一種光合色素，參與光吸收并在作物光合作用中起重要作用。干旱脅迫能夠加速葉綠素的分解，因此葉綠素可作為鑒定作物旱脅迫嚴重程度的重要指標之一[22-24]。嚴重干旱下，當光合被抑制和光激發能量過量時，作物保持較低的葉綠素含量也許有助于減少作物光氧化損傷[25]。Chen等的研究表明，葉綠素含量與抗旱性呈顯著負相關，葉綠素含量與干旱恢復顯著正相關[24]。本研究中，旱脅迫下不同生育期不同基因型玉米自交系的葉綠素含量下降明顯，多數自交系達到顯著或極顯著水平。

Guha等的研究表明，抗壞血酸、谷胱甘肽、多酚和類胡蘿卜素可能是鑒定旱脅迫下作物抗旱性的重要指標[26]。酶類和非酶類抗氧化劑的高活性水平是提高耐旱性的重要因素之一。旱脅迫下，完善的抗氧化防御系統可以防護過氧化反應，保護植物生長發育，增強抗旱性，這些研究已經在大米[27]、甘蔗[28]和小麥[29]中得以證實。

作物含有大量的類胡蘿卜素，可以作為活性氧的非酶清除劑[30-31]，主要是清除作物內的單線態氧，類胡蘿卜素主要與光合作用中心相關，因此其損傷是可以被檢測到的。Chandrasekar等的研究表明，含有較高類胡蘿卜素的基因型作物抗旱性較強[19]。Chen等對玉米自交系主成分分析表明，旱脅迫下類胡蘿卜素占很大權重，旱脅迫及復水后類胡蘿卜素與相對含水量RWC表現一致，與抗旱性呈顯著正相關[24]。本研究旱脅迫下，拔節期自交系吉853、鄭6722、鄭754和抽雄期自交系鄭6722均保持較高的類胡蘿卜素含量，并被鑒定屬于抗旱型自交系。

魯曉民等的研究報道，玉米自交系提高抗氧化酶活性來消除ROS與抗旱性相關[20-21]。本研究干旱脅迫下，拔節期和抽雄期不同基因型的玉米自交系葉片中的抗氧化防御系統酶活性（SOD和POD）均顯著或極顯著提高，但不同生育期、不同基因型自交系的活性提高不同，推測是由不同生長發育階段和基因型差異引起的。

通過熱圖來展現旱脅迫下各生理指標在不同時期不同自交系中所起的作用程度及直觀地鑒定自交系抗旱性，這種形式在抗旱研究中還不多見。本研究利用熱圖和平均隸屬函數來對玉米自交系的抗旱性進行綜合性評價，清晰、直觀地將不同基因型玉米自交系的抗旱性進行了歸類。在拔節期，鄭6613、鄭718、吉853、鄭6722、鄭7413、鄭754歸為抗旱型自交系，鄭663歸為中抗型自交系，B73和自交系DH351歸為旱敏感型自交系;在抽雄期，鄭6613、吉853、鄭6722、鄭663歸為抗旱型自交系，DH351、鄭718、鄭7413、鄭754歸為中抗型自交系，B73歸為旱敏感型自交系，熱圖和平均隸屬函數展示的歸類結果也基本一致。其中鄭6613、吉853和鄭6722自交系在拔節期和抽雄期均屬于抗旱類型，這些種質的應用對于今后培育抗旱性玉米新品種，解決黃淮海高溫干旱帶來的玉米產量損失有著重要的現實意義。

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