間歇浸沒法和浸泡法誘導木薯多倍體

符芳寧 黃俞銘 李良香 馮斗

摘要：為了比較傳統木薯浸泡法誘導多倍體和利用間歇浸沒式生物反應器（TIBS）誘導木薯多倍體的效果，以木薯良種GR891無菌組培苗為材料，利用秋水仙素進行不同濃度、不同間歇浸沒時間對木薯開展多倍體誘導試驗，并對誘導的木薯增殖苗進行染色體鑒定和細胞解剖學等生理指標的測定。結果表明，利用TIBS進行誘導的木薯多倍體誘導率優于浸泡法，秋水仙素濃度為0.10 g/L、系統間歇時間為20 min/h時，處理4 d后木薯多倍體誘導率最高，為2333%;在系統間歇時間為10 min/h、秋水仙素濃度為0.05 g/L時，處理4 d后木薯多倍體誘導率最高，為26.67%。

關鍵詞：木薯;TIBS;浸泡法;秋水仙素;誘導率

中圖分類號： S533.043 ?文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）16-0112-03

收稿日期：2018-04-13

作者簡介：符芳寧（1991—），男，海南瓊海人，碩士研究生，研究方向為作物遺傳育種。

通信作者：馮 斗，博士，教授，研究方向為（能源、熱帶）作物遺傳育種與栽培及產業化。

木薯作為三大薯類作物之一，是全球第六大糧食作物，有著“淀粉之王”的美譽，是世界近6億人口賴以生存的糧食[1]。廣西作為我國最大的木薯產區，木薯的種植面積、鮮薯產量及木薯淀粉產量都處于全國首位，但是木薯平均產量較低。多倍體育種是重要的育種方法之一，尤其是利用塊根為收獲產品的木薯培育多倍體品種，其器官一般比原倍性植株有所增大，抗逆性也增強，同時淀粉含量也相對提高。因此，培育木薯多倍體品種是木薯高產穩產的有效途徑。近年來對木薯多倍體誘導的研究屢見報道，但是利用間歇浸沒式生物反應器（TIBS）誘導木薯多倍體的研究還很少。本試驗采用不同濃度秋水仙素離體誘導木薯多倍體，并對浸泡法和TIBS法的誘導效果進行比較，以期為木薯多倍體誘導研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究采用的木薯優良品種為GR891，以經試驗培養建立的無菌組培苗作為試驗材料。

1.2 試驗方法

1.2.1 不同濃度秋水仙素在TIBS上對木薯多倍體誘導的影響

試驗共設置5個不同濃度（0、0.05、0.10、0.20、0.50 g/L）秋水仙素處理，每個濃度接種30個芽，每個瓶子裝6個芽，每個重復有5瓶。將接種好的芽放置到TIBS系統上進行誘導，TIBS設置2個不同的間歇浸沒時間，分別為10、20 min/h。除0 g/L秋水仙素處理木薯芽節在誘導第6天后接種到繼代培養基上外，其他濃度處理均在誘導第2、4、6天后接種到繼代培養基上，培養45 d后統計結果。比較不同濃度秋水仙素在不同間歇時間TIBS上對木薯多倍體的誘導情況。

1.2.2 不同濃度秋水仙素在浸泡法下對木薯誘導的影響

試驗共設置5個不同濃度（0、0.05、0.10、0.20、0.50 g/L）秋水仙素處理，選取在MS培養基中繼代培養4～6周的木薯組培苗，將生長健壯的無菌苗切成單芽莖段，用不同濃度的秋水仙素進行誘導處理，除0 g/L秋水仙素處理時間為3 d外，其余處理時間均為1、2、3 d，處理完畢后用無菌水沖洗3～4次，切除莖段兩邊以防止秋水仙素殘留，然后轉接到新的MS培養基上繼代培養，培養45 d后觀察材料，并進行統計。每個濃度接種30個芽，每瓶接種6個芽，共5瓶。

成活率=（成活的植株數/接種的單芽莖段數）×100%;

誘導率=（變異的植株數/接種的單芽莖段數）×100%。

1.2.3 染色體鑒定 多倍體木薯苗和原倍性木薯苗在形態特征上有差異，將葉色濃厚、葉片較大、肥厚、葉片不規則、莖稈粗壯、根系粗壯的組培苗篩選出來進行染色體鑒定。將誘導完成后的木薯莖段芽繼代培養在新鮮的培養基中，經過2代培養后先初步進行植株的形態學差異判斷，選出可能誘導成功的植株，然后根尖鏡檢統計變異芽數。首先，預處理參考王超等的方法[2]，具體操作為：用濾紙吸干用蒸餾水洗凈的根尖，放入0.10 g/L秋水仙素和0.002 mol/L 8-羥基喹啉混合溶液（體積比為1 ∶1）中，室溫下預處理2 h，用卡諾氏固定液固定24 h后，用蒸餾水清洗3遍，再用50%乙醇清洗1遍，最后放入70%乙醇中于4 ℃冰箱中保存。參考馮斗等的方法[3]進行染色體數鑒定。在溫度為（60±1） ℃的恒溫水浴鍋中用 1 mol/L HCl溶液處理根尖13 min。處理完成后，取出根尖，用蒸餾水清洗3遍去除鹽酸殘留液，然后浸入蒸餾水中30 min后，取出放在濾紙上吸干水分，然后放在載玻片上，用刀片切去根尖分生組織保留1.0～1.5 mm長，滴1滴改良苯酚品紅染液，染色1～2 min，蓋上蓋玻片，用鉛筆先擠壓根尖，然后輕輕敲擊蓋玻片，使材料分散均勻。

1.2.4 多倍體和二倍體解剖學比較 對木薯二倍體和多倍體的保衛細胞和氣孔形態進行比較，同時比較木薯葉片橫截面。

1.2.5 木薯塊根所含淀粉量的測定和不同倍性的葉綠素含量比較 對誘導的多倍體木薯進行大田移栽，測定大田木薯的收獲指數和塊根淀粉含量。

2 結果與分析

2.1 不同濃度秋水仙素在不同TIBS上對木薯多倍體誘導的影響

由表1可知，當TIBS系統間歇時間設置為20 min/h時，隨著秋水仙素濃度的增大，帶芽莖段整體的成活率明顯降低，在處理濃度提升至 0.50 g/L 時，外植體所對應的成活率達到極小值。在處理濃度為0.10 g/L時，處理4 d后其誘導率達到極大值，為23.33%。由表2可知，在TIBS系統間歇時間設置為10 min/h時，在濃度為0.05 g/L秋水仙素處理4 d時木薯GR891多倍體誘導率達到最大值，為26.67%。

2.2 不同濃度秋水仙素在浸泡法下對木薯多倍體誘導的影響

由表3可知，隨著秋水仙素濃度的不斷增大，帶芽莖段整體成活率明顯減少，在處理濃度提升至0.50 g/L時，外植體所對應的成活率達到極小值。在濃度為0.05 g/L秋水仙素處理2 d時，木薯GR891多倍體誘導率達到最大值，為16.67%。

2.3 誘導的木薯增殖苗多倍體和二倍體解剖學比較

從表4、表5可以看出，木薯多倍體的保衛細胞比二倍體的顯著增大，保衛細胞內的葉綠體數目也比二倍體多，由于保衛細胞的增大，在相同面積內的氣孔密度減少。在木薯葉片橫截面觀察（圖1）中，多倍體的上下表皮厚度、柵欄組織厚度、海綿組織厚度都比二倍體顯著增大。總體上，葉厚比二倍體約增厚35.82%。

2.4 誘導的木薯增殖苗葉綠素、淀粉含量測量結果

如表6所示，木薯多倍體的葉綠素a含量、葉綠素b含量、葉綠素總含量都顯著多于二倍體，其中葉綠素a的含量比二倍體多62.56%，葉綠素b的含量比二倍體多 12.50%，說明多倍體植株的光合作用強于二倍體。此外，多倍體葉綠素含量增加也體現在多倍體葉片顏色加深上。木薯多倍體的淀粉含量顯著低于二倍體，下降了7.12%。

2.5 誘導的木薯增殖苗染色體鑒定

由圖2可知，經過秋水仙素處理后，木薯二倍體加倍成多倍體。

3 結論與討論

本研究中，在TIBS系統誘導下，秋水仙素濃度為0.10 g/L、間歇時間為20 min/h時，處理4 d后木薯GR891多倍體誘導率達到最高值，為23.33%;在間歇時間為10 min/h、秋水仙素濃度為0.05 g/L時，處理4 d后木薯GR891多倍體誘導率最高值，為 26.67%。

秋水仙素對腋芽有毒害作用，由于使用浸泡法結合搖床振蕩處理，使材料與秋水仙素充分接觸，對材料危害較大，而利用TIBS誘導，木薯外植體與材料能間歇接觸，對材料危害較小，成活率也提高，從而可能提高外植體的變異率。胡燕花等利用間歇浸沒式生物反應器培養鐵皮石斛種苗，結果發現，利用TIBS系統培養的鐵皮石斛增殖率更高[4]。許建民等采用間歇浸沒法培養馬鈴薯夏泊蒂，營養間歇浸沒馬鈴薯組培苗生長最佳[5]。

本試驗僅設計了2個不同TIBS系統間歇時間，其他最適時間有待研究，另外誘導濃度的設置可以降低。

利用TIBS在處理濃度和誘導時間上提高木薯誘導率仍需要繼續試驗。

參考文獻：

[1]嚴華兵，葉劍秋，李開綿. 中國木薯育種研究進展[J]. 中國農學通報，2015，31（15）：63-70.

[2]王 超，王婧菲，莊南生，等. 木薯根尖染色體制片方法的優化[J]. 熱帶作物學報，2012，33（4）：627-630.

[3]馮 斗，王建嶺，席世麗，等. 木薯根尖染色體的觀察技術[J]. 安徽農業科學，2008，36（9）：3711-3712.

[4]胡燕花，張本厚，賈明良，等. 間歇浸沒式生物反應器培養鐵皮石斛組培苗[J]. 中國農業科技導報，2016，18（3）：190-194.

[5]許建民，王永平，王 宇. 馬鈴薯組培苗液體間歇浸沒培養初探[J]. 江蘇農業科學，2013，41（1）：53-55.