間歇浸沒法和浸泡法誘導(dǎo)木薯多倍體

符芳寧 黃俞銘 李良香 馮斗

摘要：為了比較傳統(tǒng)木薯浸泡法誘導(dǎo)多倍體和利用間歇浸沒式生物反應(yīng)器（TIBS）誘導(dǎo)木薯多倍體的效果，以木薯良種GR891無菌組培苗為材料，利用秋水仙素進(jìn)行不同濃度、不同間歇浸沒時(shí)間對(duì)木薯開展多倍體誘導(dǎo)試驗(yàn)，并對(duì)誘導(dǎo)的木薯增殖苗進(jìn)行染色體鑒定和細(xì)胞解剖學(xué)等生理指標(biāo)的測(cè)定。結(jié)果表明，利用TIBS進(jìn)行誘導(dǎo)的木薯多倍體誘導(dǎo)率優(yōu)于浸泡法，秋水仙素濃度為0.10 g/L、系統(tǒng)間歇時(shí)間為20 min/h時(shí)，處理4 d后木薯多倍體誘導(dǎo)率最高，為2333%;在系統(tǒng)間歇時(shí)間為10 min/h、秋水仙素濃度為0.05 g/L時(shí)，處理4 d后木薯多倍體誘導(dǎo)率最高，為26.67%。

關(guān)鍵詞：木薯;TIBS;浸泡法;秋水仙素;誘導(dǎo)率

中圖分類號(hào)： S533.043 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2019）16-0112-03

收稿日期：2018-04-13

作者簡(jiǎn)介：符芳寧（1991—），男，海南瓊海人，碩士研究生，研究方向?yàn)樽魑镞z傳育種。

通信作者：馮 斗，博士，教授，研究方向?yàn)椋茉础釒В┳魑镞z傳育種與栽培及產(chǎn)業(yè)化。

木薯作為三大薯類作物之一，是全球第六大糧食作物，有著“淀粉之王”的美譽(yù)，是世界近6億人口賴以生存的糧食[1]。廣西作為我國(guó)最大的木薯產(chǎn)區(qū)，木薯的種植面積、鮮薯產(chǎn)量及木薯淀粉產(chǎn)量都處于全國(guó)首位，但是木薯平均產(chǎn)量較低。多倍體育種是重要的育種方法之一，尤其是利用塊根為收獲產(chǎn)品的木薯培育多倍體品種，其器官一般比原倍性植株有所增大，抗逆性也增強(qiáng)，同時(shí)淀粉含量也相對(duì)提高。因此，培育木薯多倍體品種是木薯高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的有效途徑。近年來對(duì)木薯多倍體誘導(dǎo)的研究屢見報(bào)道，但是利用間歇浸沒式生物反應(yīng)器（TIBS）誘導(dǎo)木薯多倍體的研究還很少。本試驗(yàn)采用不同濃度秋水仙素離體誘導(dǎo)木薯多倍體，并對(duì)浸泡法和TIBS法的誘導(dǎo)效果進(jìn)行比較，以期為木薯多倍體誘導(dǎo)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究采用的木薯優(yōu)良品種為GR891，以經(jīng)試驗(yàn)培養(yǎng)建立的無菌組培苗作為試驗(yàn)材料。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 不同濃度秋水仙素在TIBS上對(duì)木薯多倍體誘導(dǎo)的影響

試驗(yàn)共設(shè)置5個(gè)不同濃度（0、0.05、0.10、0.20、0.50 g/L）秋水仙素處理，每個(gè)濃度接種30個(gè)芽，每個(gè)瓶子裝6個(gè)芽，每個(gè)重復(fù)有5瓶。將接種好的芽放置到TIBS系統(tǒng)上進(jìn)行誘導(dǎo)，TIBS設(shè)置2個(gè)不同的間歇浸沒時(shí)間，分別為10、20 min/h。除0 g/L秋水仙素處理木薯芽節(jié)在誘導(dǎo)第6天后接種到繼代培養(yǎng)基上外，其他濃度處理均在誘導(dǎo)第2、4、6天后接種到繼代培養(yǎng)基上，培養(yǎng)45 d后統(tǒng)計(jì)結(jié)果。比較不同濃度秋水仙素在不同間歇時(shí)間TIBS上對(duì)木薯多倍體的誘導(dǎo)情況。

1.2.2 不同濃度秋水仙素在浸泡法下對(duì)木薯誘導(dǎo)的影響

試驗(yàn)共設(shè)置5個(gè)不同濃度（0、0.05、0.10、0.20、0.50 g/L）秋水仙素處理，選取在MS培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)4～6周的木薯組培苗，將生長(zhǎng)健壯的無菌苗切成單芽莖段，用不同濃度的秋水仙素進(jìn)行誘導(dǎo)處理，除0 g/L秋水仙素處理時(shí)間為3 d外，其余處理時(shí)間均為1、2、3 d，處理完畢后用無菌水沖洗3～4次，切除莖段兩邊以防止秋水仙素殘留，然后轉(zhuǎn)接到新的MS培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)，培養(yǎng)45 d后觀察材料，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。每個(gè)濃度接種30個(gè)芽，每瓶接種6個(gè)芽，共5瓶。

成活率=（成活的植株數(shù)/接種的單芽莖段數(shù)）×100%;

誘導(dǎo)率=（變異的植株數(shù)/接種的單芽莖段數(shù)）×100%。

1.2.3 染色體鑒定 多倍體木薯苗和原倍性木薯苗在形態(tài)特征上有差異，將葉色濃厚、葉片較大、肥厚、葉片不規(guī)則、莖稈粗壯、根系粗壯的組培苗篩選出來進(jìn)行染色體鑒定。將誘導(dǎo)完成后的木薯莖段芽繼代培養(yǎng)在新鮮的培養(yǎng)基中，經(jīng)過2代培養(yǎng)后先初步進(jìn)行植株的形態(tài)學(xué)差異判斷，選出可能誘導(dǎo)成功的植株，然后根尖鏡檢統(tǒng)計(jì)變異芽數(shù)。首先，預(yù)處理參考王超等的方法[2]，具體操作為：用濾紙吸干用蒸餾水洗凈的根尖，放入0.10 g/L秋水仙素和0.002 mol/L 8-羥基喹啉混合溶液（體積比為1 ∶1）中，室溫下預(yù)處理2 h，用卡諾氏固定液固定24 h后，用蒸餾水清洗3遍，再用50%乙醇清洗1遍，最后放入70%乙醇中于4 ℃冰箱中保存。參考馮斗等的方法[3]進(jìn)行染色體數(shù)鑒定。在溫度為（60±1） ℃的恒溫水浴鍋中用 1 mol/L HCl溶液處理根尖13 min。處理完成后，取出根尖，用蒸餾水清洗3遍去除鹽酸殘留液，然后浸入蒸餾水中30 min后，取出放在濾紙上吸干水分，然后放在載玻片上，用刀片切去根尖分生組織保留1.0～1.5 mm長(zhǎng)，滴1滴改良苯酚品紅染液，染色1～2 min，蓋上蓋玻片，用鉛筆先擠壓根尖，然后輕輕敲擊蓋玻片，使材料分散均勻。

1.2.4 多倍體和二倍體解剖學(xué)比較 對(duì)木薯二倍體和多倍體的保衛(wèi)細(xì)胞和氣孔形態(tài)進(jìn)行比較，同時(shí)比較木薯葉片橫截面。

1.2.5 木薯塊根所含淀粉量的測(cè)定和不同倍性的葉綠素含量比較 對(duì)誘導(dǎo)的多倍體木薯進(jìn)行大田移栽，測(cè)定大田木薯的收獲指數(shù)和塊根淀粉含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度秋水仙素在不同TIBS上對(duì)木薯多倍體誘導(dǎo)的影響

由表1可知，當(dāng)TIBS系統(tǒng)間歇時(shí)間設(shè)置為20 min/h時(shí)，隨著秋水仙素濃度的增大，帶芽莖段整體的成活率明顯降低，在處理濃度提升至 0.50 g/L 時(shí)，外植體所對(duì)應(yīng)的成活率達(dá)到極小值。在處理濃度為0.10 g/L時(shí)，處理4 d后其誘導(dǎo)率達(dá)到極大值，為23.33%。由表2可知，在TIBS系統(tǒng)間歇時(shí)間設(shè)置為10 min/h時(shí)，在濃度為0.05 g/L秋水仙素處理4 d時(shí)木薯GR891多倍體誘導(dǎo)率達(dá)到最大值，為26.67%。

2.2 不同濃度秋水仙素在浸泡法下對(duì)木薯多倍體誘導(dǎo)的影響

由表3可知，隨著秋水仙素濃度的不斷增大，帶芽莖段整體成活率明顯減少，在處理濃度提升至0.50 g/L時(shí)，外植體所對(duì)應(yīng)的成活率達(dá)到極小值。在濃度為0.05 g/L秋水仙素處理2 d時(shí)，木薯GR891多倍體誘導(dǎo)率達(dá)到最大值，為16.67%。

2.3 誘導(dǎo)的木薯增殖苗多倍體和二倍體解剖學(xué)比較

從表4、表5可以看出，木薯多倍體的保衛(wèi)細(xì)胞比二倍體的顯著增大，保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)的葉綠體數(shù)目也比二倍體多，由于保衛(wèi)細(xì)胞的增大，在相同面積內(nèi)的氣孔密度減少。在木薯葉片橫截面觀察（圖1）中，多倍體的上下表皮厚度、柵欄組織厚度、海綿組織厚度都比二倍體顯著增大。總體上，葉厚比二倍體約增厚35.82%。

2.4 誘導(dǎo)的木薯增殖苗葉綠素、淀粉含量測(cè)量結(jié)果

如表6所示，木薯多倍體的葉綠素a含量、葉綠素b含量、葉綠素總含量都顯著多于二倍體，其中葉綠素a的含量比二倍體多62.56%，葉綠素b的含量比二倍體多 12.50%，說明多倍體植株的光合作用強(qiáng)于二倍體。此外，多倍體葉綠素含量增加也體現(xiàn)在多倍體葉片顏色加深上。木薯多倍體的淀粉含量顯著低于二倍體，下降了7.12%。

2.5 誘導(dǎo)的木薯增殖苗染色體鑒定

由圖2可知，經(jīng)過秋水仙素處理后，木薯二倍體加倍成多倍體。

3 結(jié)論與討論

本研究中，在TIBS系統(tǒng)誘導(dǎo)下，秋水仙素濃度為0.10 g/L、間歇時(shí)間為20 min/h時(shí)，處理4 d后木薯GR891多倍體誘導(dǎo)率達(dá)到最高值，為23.33%;在間歇時(shí)間為10 min/h、秋水仙素濃度為0.05 g/L時(shí)，處理4 d后木薯GR891多倍體誘導(dǎo)率最高值，為 26.67%。

秋水仙素對(duì)腋芽有毒害作用，由于使用浸泡法結(jié)合搖床振蕩處理，使材料與秋水仙素充分接觸，對(duì)材料危害較大，而利用TIBS誘導(dǎo)，木薯外植體與材料能間歇接觸，對(duì)材料危害較小，成活率也提高，從而可能提高外植體的變異率。胡燕花等利用間歇浸沒式生物反應(yīng)器培養(yǎng)鐵皮石斛種苗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，利用TIBS系統(tǒng)培養(yǎng)的鐵皮石斛增殖率更高[4]。許建民等采用間歇浸沒法培養(yǎng)馬鈴薯夏泊蒂，營(yíng)養(yǎng)間歇浸沒馬鈴薯組培苗生長(zhǎng)最佳[5]。

本試驗(yàn)僅設(shè)計(jì)了2個(gè)不同TIBS系統(tǒng)間歇時(shí)間，其他最適時(shí)間有待研究，另外誘導(dǎo)濃度的設(shè)置可以降低。

利用TIBS在處理濃度和誘導(dǎo)時(shí)間上提高木薯誘導(dǎo)率仍需要繼續(xù)試驗(yàn)。

參考文獻(xiàn)：

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[2]王 超，王婧菲，莊南生，等. 木薯根尖染色體制片方法的優(yōu)化[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)，2012，33（4）：627-630.

[3]馮 斗，王建嶺，席世麗，等. 木薯根尖染色體的觀察技術(shù)[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36（9）：3711-3712.

[4]胡燕花，張本厚，賈明良，等. 間歇浸沒式生物反應(yīng)器培養(yǎng)鐵皮石斛組培苗[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào)，2016，18（3）：190-194.

[5]許建民，王永平，王 宇. 馬鈴薯組培苗液體間歇浸沒培養(yǎng)初探[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（1）：53-55.