大孔樹脂純化甜茶葉總黃酮及其純化前后的抗氧化性

吳婕 吳學慧 徐高

摘要：通過對比聚酰胺、DM-130、LSA-40、DHP-600與FL-1等5種大孔樹脂的靜態“吸附-解吸”性能，篩選出最適合甜茶葉總黃酮分離純化的大孔樹脂，并對其動態純化工藝條件進行探討。結果表明，最適大孔樹脂的動態“吸附-解吸”參數如下：上樣液質量濃度為2.0 mg/mL，上樣液體積為60 mL，上樣液pH值為5.0，上樣流速為 2 BV/h，洗脫劑乙醇體積分數為70%，洗脫劑用量為70 mL，洗脫流速為2 BV/h。在此優化條件下，得到甜茶葉總黃酮的純度為39.6%。并且在抗氧化研究中，純化后的甜茶葉總黃酮對2，2-聯氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）自由基的抗氧化能力半抑制濃度（IC50值）由108.7 μg/mL降低到77.6 μg/mL。由結果可知，甜茶葉總黃酮經過FL-1大孔樹脂的純化，能夠提高抗氧化能力，因此，它具有很好的醫藥保健品生產前景。

關鍵詞：甜茶葉;總黃酮;FL-1大孔樹脂;抗氧化性

中圖分類號： R284 ?文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）16-0190-04

收稿日期：2018-09-12

基金項目：赤水河流域環境保護與山地農業發展協同創新中心開放基金（編號：遵師協同創新[2018]06）。

作者簡介：吳 婕（1982—），女，貴州銅仁人，碩士，副教授，主要從事天然產物研究。Tel：（0856）5238982;

甜茶葉，別稱傘花八仙葉，其味微甜，屬于薔薇科懸鉤子屬多年生多刺灌木，主要分布在廣西、廣東、湖南、貴州、江西等地[1]。甜茶葉既可入茶，亦可入藥，被稱為“神茶”。甜茶葉富含多種營養物質和微量元素，如生物類黃酮、氨基酸、鍶、維生素B1、B2、B3、超氧化物歧化酶等。其中，黃酮類化合物可以降低血脂和膽固醇，也有抗炎和抗氧化作用[2-4]。因此分離純化甜茶葉總黃酮，對于提高甜茶葉總黃酮的工業生產價值有重要意義。

在分離純化植物活性成分的方法中，大孔樹脂因具有成本低、無污染、操作簡單、選擇性好、可再生等優點而備受人們關注[5-7]，但是用大孔樹脂分離純化甜茶葉總黃酮的研究卻鮮有報道。本研究以甜茶葉總黃酮的吸附量、吸附率與解吸率為考察指標，比較5種大孔樹脂對總黃酮的“吸附-解吸”性能，篩選出最適宜分離純化甜茶葉總黃酮的大孔樹脂，并且通過大孔樹脂的動態“吸附-解吸”試驗，得到最適合大孔樹脂分離純化甜茶葉總黃酮的優化工藝參數。通過抗氧化性試驗，表明優化條件下大孔樹脂純化甜茶葉總黃酮的抗氧化能力得到了較大提高。研究結果可為工業化生產甜茶葉總黃酮提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甜茶葉，貴州健康茶科技有限公司;聚酰胺（60～100目），滄州寶恩吸附材料有限公司;DHP-600、FL-1型樹脂，天津歐瑞生物科技有限公司;DM-130、LSA-40型樹脂，鄭州勤實科技有限公司;蕓香苷標準品（分析純），合肥博美生物有限公司;乙醇、氫氧化鈉、鹽酸等均為國產分析純。

UV2300分光計，上海天美科學儀器有限公司;KL04A型離心機，湖南凱達公司;XT120A型電子天平，瑞士普利賽斯公司;FZ102微型植物粉碎機，上海書培實驗設備有限公司;RE-52AA旋轉蒸發儀，上海亞榮生化儀器廠;SHA-B恒溫振蕩儀，金壇市富華儀器有限公司。

1.2 黃酮含量的測定

采用NaNO2-Al（NO3）3顯色法測定黃酮含量。精確配制濃度為0.202 mg/mL的蕓香苷標準品溶液，分別在25 mL容量瓶中加入0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL標準品溶液，加蒸餾水至總體積為6.0 mL;加入1.0 mL 5% NaNO2溶液，搖勻靜置10 min后，加入1.0 mL 10% Al（NO3）3溶液，搖勻靜置10 min后，加入10.0 mL 4% NaOH溶液，用蒸餾水定容至刻度處，搖勻靜置20 min。在波長510 nm處測定吸光度。以質量濃度為橫坐標、吸光度為縱坐標，繪制總黃酮質量濃度的標準曲線方程：y=6.749 9x-0.030 4（r2=0.999 7）。

1.3 大孔樹脂吸附量、吸附率、解吸率及甜茶葉總黃酮純度的計算

大孔樹脂的吸附量、吸附率、解吸率及甜茶葉總黃酮純度的計算公式如下：

H=（CⅠ-CⅡ）×VⅠ/MⅠ;（1）

P=（CⅠ-CⅡ）/CⅠ×100%;（2）

Q=CⅢ×VⅡ/[（CⅠ-CⅡ）×VⅠ]×100%;（3）

L=（CⅢ×VⅡ）/MⅡ×100%。（4）

式中：H為吸附量，mg/g;P為吸附率，%;Q為解吸率，%;L為純度，%;CⅠ、CⅡ、CⅢ分別為初始、吸附平衡、解吸平衡的甜茶葉總黃酮的質量濃度，mg/mL;VⅠ、VⅡ分別為上樣液甜茶葉總黃酮體積、解吸液乙醇體積，mL;MⅠ為大孔樹脂的干質量，g;MⅡ為大孔樹脂純化后旋干物質的質量，g。

1.4 粗制甜茶葉總黃酮的方法

采用超聲輔助浸提甜茶葉總黃酮技術，提取條件如下：超聲波功率為120 W，提取時間為30 min，乙醇體積分數為75%，液料比為15 mL ∶1 g，提取溫度為60 ℃，提取次數為2次，離心（1 800 r/min、15～20 min），取上清液，濃縮，旋干，得到粗制的甜茶葉總黃酮，備用。

1.5 大孔樹脂的活化

用無水乙醇將大孔樹脂浸泡24 h，再用蒸餾水洗去醇溶性雜質至無醇味，然后用4% HCl溶液浸泡4 h，再用蒸餾水沖洗酸溶性雜質至中性，然后用4% NaOH溶液浸泡4 h，最后用蒸餾水沖洗堿溶性雜質至中性，備用。

1.6 大孔樹脂對甜茶葉總黃酮靜態“吸附-解吸”性能的研究

在室溫下，稱取2.0 g大孔樹脂于具塞三角瓶中，加入粗制的甜茶葉總黃酮溶液（濃度為0.93 mg/mL;體積為 80 mL），振蕩24 h，測定吸附平衡后的甜茶葉總黃酮質量濃度。將吸附平衡后的大孔樹脂先用蒸餾水沖洗至無色，再加入80 mL無水乙醇解吸液，振蕩24 h，測定大孔樹脂解吸后的甜茶葉總黃酮質量濃度。根據“1.3”節中的公式計算大孔樹脂的吸附量、吸附率和解吸率，篩選出最合適純化甜茶葉總黃酮的大孔樹脂。

1.7 FL-1大孔樹脂對甜茶葉總黃酮的動態“吸附-解吸”性能研究

大孔樹脂在吸附過程中，除了本身的物理化學性質以外，上樣液質量濃度、上樣液pH值及上樣流速都是影響大孔樹脂純化效果的重要因素。在室溫下，用濕法將20 mL活化的FL-1大孔樹脂裝入層析柱（半徑×高=10 mm×400 mm）中，考察甜茶葉總黃酮的上樣液質量濃度（1.0、2.0、3.0、4.0 mg/mL）、上樣液pH值（4.0、5.0、6.0、7.0、8.0）、上樣流速（1、2、3 BV/h）與不同上樣體積對FL-1大孔樹脂吸附率的影響;此外，考察洗脫液乙醇的體積分數（50%、60%、70%、80%）及洗脫液體積對FL-1大孔樹脂解吸率的影響。

1.7.1 上樣液質量濃度對FL-1大孔樹脂吸附率的影響 為了使加入的甜茶葉總黃酮的量相等，分別設pH值為5.0，上樣液體積為80、40、26.7、20 mL，質量濃度為1.0、2.0、3.0、4.0 mg/mL，以2 BV/h的流速加入FL-1大孔樹脂柱中。收集流出液并測定總黃酮的質量濃度，得出FL-1大孔樹脂對不同質量濃度總黃酮的吸附率。

1.7.2 上樣液pH值對FL-1大孔樹脂吸附率的影響 取100 mL上樣液，甜茶葉總黃酮質量濃度為2 mg/mL，pH值分別設為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，以2 BV/h的流速加入FL-1大孔樹脂柱中，收集流出液并測定總黃酮的質量濃度，考察甜茶葉總黃酮溶液pH值對大孔樹脂吸附率的影響。

1.7.3 上樣液流速對FL-1樹脂吸附率的影響 取80 mL甜茶葉總黃酮上樣液，質量濃度為2.0 mg/mL，pH值為5.0，分別以1、2、3 BV/h的流速加入FL-1大孔樹脂柱中，按 5 mL/管收集流出液并測定總黃酮的質量濃度，直至流出液的質量濃度是原上樣液質量濃度的1/10，繪制不同流速對應的FL-1大孔樹脂柱動態吸附穿透曲線，找出泄漏點，得到最適宜的上樣流速和上樣體積。

1.7.4 洗脫劑體積分數對FL-1大孔樹脂解吸性能的影響 ?向吸附飽和的FL-1大孔樹脂柱中，以3 BV/h的洗脫流速，加入60 mL體積分數分別為50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液進行洗脫，收集洗脫液，測定總黃酮的質量濃度，得到不同體積分數洗脫劑的解吸率。

1.7.5 洗脫流速和洗脫劑體積對FL-1大孔樹脂解吸性能的影響 向吸附甜茶葉總黃酮的飽和FL-1大孔樹脂柱中，加入體積分數為70%的乙醇溶液，分別以1、2、3 BV/h的流速進行洗脫。按10 mL/管收集洗脫液，測定洗脫液的總黃酮質量濃度，計算FL-1大孔樹脂柱在不同洗脫速度下的動態解吸率，確定最佳洗脫流速和洗脫液用量。

1.8 FL-1大孔樹脂純化工藝的驗證

得到粗制的甜茶葉總黃酮溶液（pH值為5.0，濃度為 2.0 mg/mL，體積為60 mL）后，設上樣流速為2 BV/h，加入 20 mL FL-1大孔樹脂層析柱（半徑×高=10 mm×400 mm）中，進行動態吸附，收集流出液，計算吸附率。當FL-1大孔樹脂柱吸附平衡后，按照2 BV/h的洗脫速度，加入70 mL體積分數為70%的乙醇溶液進行洗脫，收集流出液，計算解吸率。進行3次平行試驗，取均值，驗證FL-1大孔樹脂純化甜茶葉總黃酮的可行性及穩定性。

1.9 粗制和純化的甜茶葉總黃酮對2，2-聯氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）自由基的抗氧化性

將粗制和純化的甜茶葉總黃酮配制成不同質量濃度的待測液，同時以維生素C作為參比。參考林戀竹等的方法[7]，測定它們對ABTS自由基的清除率。

2 結果與分析

2.1 大孔樹脂的靜態“吸附-解吸”試驗

大孔樹脂的空間結構、極性和粒徑決定其對活性成分的“吸附-解吸”性能。由表1可以看出，在相同條件下，5種大孔樹脂對甜茶葉總黃酮都有一定的“吸附-解吸”能力，其靜態吸附能力排序為FL-1>聚酰胺（60～100目）>HPD-600>LSA-40>DM-130;其靜態解吸能力排序為HPD-600>FL-1>LSA-40>DM-130>聚酰胺（60～100目）。綜合考慮吸附率和解吸率，FL-1大孔樹脂是純化甜茶葉總黃酮較為理想的樹脂。

2.2 FL-1大孔樹脂的動態“吸附-解吸”性能研究

2.2.1 上樣液質量濃度對FL-1大孔樹脂吸附率的影響 由圖1可知，當上樣液濃度為1.0 mg/mL時，FL-1大孔樹脂的吸附率達到最大值93%。當上樣液的質量濃度為1.0～2.0 mg/mL 時，FL-1大孔樹脂的吸附率隨著上樣液質量濃度的增加而緩慢降低，若繼續增加上樣液質量濃度，其吸附率迅速降低。這是由于在等溫條件下，當上樣液質量濃度較低時，黃酮類化合物與樹脂接觸得越充分，大孔樹脂的吸附率越高，但是吸附量較小;當上樣液質量濃度過大時，受到大孔樹脂吸附容量和孔容的影響，導致大孔樹脂吸附量、吸附率均減小。考慮到上樣液質量濃度過低會導致吸附量太小，純化效率不高，而上樣液質量濃度過高會導致大孔樹脂吸附不充分，浪費原料。因此，甜茶葉總黃酮的上樣液質量濃度選擇 2.0 mg/mL 為共宜。

2.2.2 上樣液pH值對FL-1大孔樹脂吸附率的影響 如圖2所示，FL-1大孔樹脂對甜茶葉總黃酮的吸附率隨著上樣溶液pH值的增加呈現先升高后降低的趨勢。當pH值為5.0時，甜茶葉總黃酮的吸附率達到最大值89%，這是因為當上樣溶液pH值為5.0時，溶液中的黃酮類化合物主要以分子形式存在，有利于FL-1大孔樹脂的吸附。若上樣溶液pH值較小，黃酮分子易形成“徉鹽”;若上樣溶液pH值較大，黃酮類化合物以離子狀態存在，都不利于FL-1大孔樹脂對甜茶葉總黃酮發生物理吸附作用。因此，甜茶葉總黃酮上樣液的pH值為5.0時較適宜。

2.2.3 上樣液流速和上樣體積的確定 由圖3可知，甜茶葉總黃酮的上樣流速越快，滲漏點也出現得越早。當上樣流速為1 BV/h時，上樣體積約為80 mL時出現泄露點;當上樣流速為2 BV/h時，上樣體積約為60 mL時出現泄漏點;當上樣流速為3 BV/h時，上樣體積約為30 mL時就出現了泄漏點。因為大孔樹脂的吸附過程主要是活性成分在大孔樹脂的膜擴散和粒擴散的過程[8]，上樣流速越快，甜茶葉黃酮類化合物與大孔樹脂接觸的時間越短，它們還沒有來得及被吸附到樹脂表面或孔內就流出樹脂柱。所以，在上樣液質量濃度相同的情況下，當上樣流速為3 BV/h時，FL-1大孔樹脂柱對甜茶葉總黃酮的吸附量小，吸附率較低;當上樣流速為1 BV/h時，FL-1大孔樹脂柱對甜茶葉總黃酮的吸附量和吸附率相對較高。然而，在實際工業生產中，上樣流速過慢會導致生產效率低，因此選擇上樣流速為2 BV/h較好，并且在此條件下的最佳上樣體積為60 mL。

2.2.4 不同體積分數的洗脫劑對FL-1大孔樹脂洗脫效果的影響 由圖4可知，隨著洗脫液乙醇體積分數的增加，甜茶葉總黃酮的洗脫率先提高后略有降低。當乙醇體積分數為50%～70%時，乙醇體積分數越大，它對甜茶葉黃酮類化合物的解吸率也越高;當乙醇體積分數為70%時，甜茶葉總黃酮的解吸率為83%;當乙醇體積分數為80%時，甜茶葉總黃酮的解吸率為85%。但是與體積分數為70%的乙醇得到的洗脫率相比，體積分數為80%的乙醇得到的解吸率提高得較慢。這是因為乙醇體積分數越大，洗脫劑的極性越弱，較小極性的黃酮類化合物更加容易被洗脫[9];但是當乙醇體積分數過大時，醇溶性雜質會增多，它們會與甜茶葉黃酮類化合物形成競爭，使甜茶葉黃酮類化合物與乙醇-水分子結合的可能性下降，導致甜茶葉總黃酮解吸率降低。綜合考慮，乙醇溶液的體積分數以70%為宜。

2.2.5 洗脫劑流速及洗脫體積的確定 由圖5可知，隨著洗脫液流速的增加，洗脫出的甜茶葉總黃酮的質量濃度形成的峰形越寬，并且拖尾現象越明顯，洗脫體積也越大;但是洗脫流速太小會導致洗脫時間過長，工業生產效率低。綜合考慮，最佳洗脫流速為2 BV/h，最佳洗脫體積用量為70 mL。

2.3 FL-1大孔樹脂純化工藝的驗證

由表2可知，FL-1大孔樹脂對甜茶葉總黃酮的吸附、解吸和純化的性能較好，其吸附量、解吸率、解吸后的純度分別為41.7 mg/g、81.5%、39.6%。因此可見，在工業生產中 FL-1大孔樹脂純化甜茶葉總黃酮具有操作上的可行性。

2.4 純化前后的甜茶葉總黃酮對ABTS自由基清除能力的比較

ABTS·是由強氧化劑與ABTS鹽反應制備的，其氧化還原電勢較低，可以通過電子傳遞（ET）反應機制或者通過氫原子轉移（HAT）機制使自由基失去活性，從而導致體系綠色減退[9]。由圖6可以看出，純化前后的甜茶葉總黃酮對ABTS自由基均具有一定的清除能力，并且清除率與總黃酮的質量濃度有較強的正相關性（r2=0.97）;當甜茶葉總黃酮質量濃度相同時，純化后的總黃酮清除能力更接近維生素C，純化后的總黃酮對ABTS自由基清除的半抑制濃度（IC50值）由1087 μg/mL降至77.6 μg/mL。由此可見，FL-1純化的甜茶葉總黃酮具有較強的抗氧化能力。

3 結論

通過靜態“吸附-解吸”試驗，篩選出最適用于甜茶葉總黃酮分離純化的FL-1大孔樹脂。在動態“吸附-解吸”試驗中，得到FL-1大孔樹脂優化甜茶葉總黃酮的純化工藝參數：上樣液質量濃度為2.0 mg/mL，上樣液體積為60 mL，上樣液pH值為5，上樣流速為2 BV/h;洗脫劑乙醇體積分數為70%，洗脫劑用量為70 mL，洗脫流速為2 BV/h。在此條件下，得到甜茶葉總黃酮的純度為39.6%。在抗氧化性研究中，當甜茶葉總黃酮質量濃度相同時，純化后的總黃酮對ABTS自由基清除的IC50由108.7 μg/mL降至77.6 μg/mL，用FL-1純化的甜茶葉總黃酮具有較強的抗氧化能力。綜合分析可知，FL-1大孔樹脂分離純化甜茶葉總黃酮的純化效率高，純化后的總黃酮更具有商業價值。

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