金銀花總三萜提取工藝及其抗菌抗氧化活性

常霞 景炳年 范毅 王偉 劉雨晴 李智寧 郭唯 魏磊

摘要：以金銀花為原料，乙醇為溶劑，考察超聲輔助提取金銀花總三萜的最佳工藝。在單因素（料液比、乙醇濃度、超聲時間和超聲溫度）試驗基礎上，利用響應面法，研究各因素間相互作用及對三萜提取率的影響，獲得最佳提取工藝為料液比1 g ∶30 mL、乙醇濃度75%、超聲時間50 min、超聲溫度45 ℃，驗證試驗結果顯示，三萜提取率為371%，與理論值接近;通過微量稀釋法檢測常見致病菌對金銀花總三萜的敏感性，最小抑菌濃度范圍在3～24 mg/mL之間，證明金銀花三萜具有較強的抗菌作用;DPPH、ABTS自由基清除試驗IC50分別為26.1、18.8 mg/mL，說明金銀花三萜具有一定的抗氧化活性。本研究為金銀花三萜進一步的研究開發提供了科學依據。

關鍵詞：金銀花;總三萜;響應面;抗菌;抗氧化;提取工藝

中圖分類號：R284 ??文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）16-0178-05

收稿日期：2018-05-14

基金項目：河南省科技攻關項目（編號：182102310061）;河南省科學院基本科研項目（編號18JK16015）。

作者簡介：常 霞（1963—），女，山西陵川人，高級工程師，從事中藥化學研究。Tel：（0371）65353099;

通信作者：魏 磊，博士，助理研究員，從事植物化學及分子生物學研究。Tel：（0371）65353099;

金銀花是忍冬科植物忍冬（Lonicera japonica Thunb.）的干燥花蕾或初開的花，具有清熱解毒、疏散風熱之功效，多用于治療癰腫疔瘡、喉痹、丹毒、熱毒血痢、風熱感冒、溫病發熱等病癥[1]，其藥用成分主要包括揮發油、有機酸類、黃酮和三萜類化合物。三萜類化合物具有抗菌、抗病毒、抗癌、抗炎、降血脂、降低膽固醇、增加免疫力等多種藥理功能[2-5]，且毒性較低，因此成為中外研究的熱點之一[6]。目前，從金銀花中已分離出30多個三萜類化合物[7]，并有保肝和利膽的功效[8]，但針對金銀花中三萜類化合物的總量、提取工藝及抗菌抗氧化活性等方面的研究未見報道。

提取是回收和純化生物活性物質最初始且重要的一步，多種因素會影響提取效率和產量[9]，因此優化提取工藝最大程度提取生物活性物質十分必要。超聲波提取技術提取效率高、耗能低、不破壞活性成分[10]。同時，響應面法可以對多種影響提取效率的因素及因素間相互作用進行有效性分析[11]。近年來，響應面法結合超聲輔助提取技術在優化黃酮[12]、多糖[13]等天然活性成分的提取工藝中得到廣泛應用。本研究采用響應面法優化金銀花總三萜的超聲輔助提取工藝，并考察提取所得的金銀花總三萜對人體常見致病菌的抑菌活性及抗氧化活性，旨在為金銀花總三萜的進一步研究開發奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金銀花產自河南省封丘縣，由新鄉博凱生物技術有限公司提供;7種常見致病菌（大腸桿菌ATCC 25922、金黃色葡萄球菌ATCC 29213、化膿性鏈球菌ATCC 19615、鼠傷寒沙門氏菌ATCC 13311、肺炎鏈球菌ATCC 49619、銅綠假單胞菌ATCC 27853、肺炎克雷伯氏菌ATCC 700603）均購自南京便診生物科技有限公司;齊墩果酸標準品購自中國藥品生物制品檢定所;胰蛋白胨購自上海寶錄生物科技有限公司;牛肉浸膏購自北京雙旋微生物培養基制品廠;D-101大孔吸附樹脂購自天津市光復精細化工研究所;微量MIC測定板購自美國Corning公司;DPPH、ABTS購自梯希愛（上海）化成工業發展有限公司;無水乙醇、香草醛、冰醋酸、高氯酸等均為分析純，購自北京化工廠。

ME-204型電子天平;wi93008型麥氏比濁儀;DHP-9082型電熱恒溫培養箱;SYQ-DSX-280B手提式壓力蒸汽滅菌鍋;YJ-VS-2型超凈工作臺;KQ-500E型超聲波清洗儀;TU-1810型紫外分光光度計;XMTD-7000型恒溫水浴鍋;Bio-rad iMarkTM型酶標儀。

1.2 方法

1.2.1 金銀花三萜提取工藝流程

金銀花打粉后過60目篩，稱定1.00 g于100 mL錐形瓶中，以一定料液比加入一定濃度的乙醇溶液，在一定溫度下超聲提取一定時間，重復3次，濾液合并后濃縮定容，取適量測定總三萜含量。

1.2.2 三萜含量測定方法

1.2.2.1 標準曲線的繪制

以齊墩果酸為標準品，采用香草醛-冰醋酸-高氯酸分光光度法測定總三萜含量。稱定標準品4.00 mg，甲醇定容至10 mL容量瓶中。準確移取該溶液0、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 mL分別加入10 mL容量瓶中，揮盡溶劑。加入0.4 mL新鮮配制的5%香草醛-冰醋酸溶液和1 mL高氯酸，搖勻后置于60 ℃水浴中加熱30 min。取出冷卻至室溫，加冰醋酸定容至10 mL搖勻，在550 nm波長下測定吸光度。以齊敦果酸含量x為橫坐標，吸光度y為縱坐標，繪制標準曲線，回歸方程為：y=28.175x-0.007 3，r2=0.999 2。說明齊墩果酸標準品在0～0.02 mg/mL范圍內線性關系良好。

1.2.2.2 三萜含量測定

根據“1.2.2.1”項下回歸方程，計算提取液總三萜含量。提取率計算公式為：

三萜提取率=三萜質量濃度×提取液體積×稀釋倍數/金銀花質量×100%。

1.2.3 金銀花提取單因素試驗及響應面設計

選定料液比（A）、乙醇濃度（B）、超聲時間（C）、超聲溫度（D）4個因素作單因素試驗，在此基礎上進行響應面設計，根據Box-Behnken試驗設計原理，采用4因素3水平共29組試驗對提取工藝進行優化分析，因素水平見表1，試驗條件及結果見表2。

1.2.4 金銀花總三萜制備

D-101大孔吸附樹脂經乙醇和蒸餾水預處理后，濕法裝柱，平衡后上樣（金銀花醇提物），然后用蒸餾水及30%、50%、70%、95%乙醇溶液依次洗脫，收集各項洗脫液，濃縮，凍干，以95%乙醇洗脫項制備金銀花總三萜，并將其配制成濃度為96 mg/mL的母液。

1.2.5 抑菌活性測定

1.2.5.1 菌株復蘇及菌懸液的制備

上述7種供試菌種復蘇后接種于固體培養基上，培養12～24 h。從平板上挑取單個菌落，混懸于液體培養基中，制成濃度為106～108 CFU/mL的菌懸液，備用。

1.2.5.2 最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC）的測定

用微量稀釋法測定金銀花總三萜的最小抑菌濃度。首先用0.22 μm濾膜過濾“1.2.4”節藥液母液，用制備好的液體培養基依次倍比稀釋成9個濃度后，加入微量MIC測定板中，每孔0.1 mL;再分別加入“1.2.5.1”節的各種菌液，每孔0.1 mL。設置陽性對照（加入0.1 mL菌液和0.1 mL液體培養基）和陰性對照（只加液體培養基）。測定板于37 ℃恒溫箱中培養24 h觀察結果，完全沒有細菌生長時的最低濃度即為最小抑菌濃度。將無菌生長的各孔取樣，分別涂布于無菌瓊脂平板上，37 ℃培養24 h觀察結果，以平板上無細菌生長的最低藥物濃度為最小殺菌濃度。

1.2.6 抗氧化活性測定

1.2.6.1 DPPH自由基清除率測定

參照Blois的方法[14]測定，略有變動。取質量濃度分別為3、6、12、24、48、96 mg/mL樣品溶液100 μL，加入0.2 mmol/L DPPH溶液100 μL，充分混勻，避光靜置30 min后，以甲醇為空白對照，抗壞血酸為陽性對照，于517 nm波長處測吸光度。每一樣品平行測3次，取平均值。清除率公式表示為：

DPPH清除率=（1-D1/D2）×100%。

式中：D1為樣品或者陽性對照吸光度;D2為空白對照吸光度。

1.2.6.2 ABTS自由基清除率測定

參照Re等的方法[15]測定。在反應體系中，樣品溶液質量濃度亦分別為3、6、12、24、48、96 mg/mL，體積100 μL，以甲醇為空白對照，抗壞血酸為陽性對照。每一樣品平行測3次取平均值。

上述所有試驗于2017年7—11月在河南省科學院天然產物重點試驗室完成。

2 結果與分析

2.1 單因素對金銀花三萜提取率的影響

2.1.1 料液比

設定乙醇濃度60%、超聲時間50 min、溫度50 ℃，考察不同料液比（1 g ∶10 mL，1 g ∶15 mL，1 g ∶20 mL，1 g ∶25 mL，1 g ∶30 mL，1 g ∶35 mL）對金銀花三萜提取率的影響，結果見圖1-A。隨溶劑體積的增加，提取率逐漸增大，1 g ∶30 mL達到最大，之后不再增加，因此選擇較佳料液比為1 g ∶30 mL。

2.1.2 乙醇濃度

設定料液比1 g ∶30 mL、超聲時間 50 min、溫度50 ℃，考察不同乙醇濃度（20%、40%、60%、80%、100%）對金銀花三萜提取率的影響，結果見圖1-B。隨著乙醇濃度增加，提取率增大，80%達到最大;之后提取率不升反降，可能由于金銀花三萜極性與80%乙醇相似，選擇80%乙醇為最佳提取濃度。

2.1.3 超聲時間

設定料液比1 g ∶30 mL、乙醇濃度80%、溫度50 ℃，考察不同超聲時間（20、40、60、80、100 min）對金銀花三萜提取率的影響，結果見圖1-C。40 min時提取率陡然上升，此后逐漸下降，可能超聲時間延長，使三萜化合物發生部分轉化，故選擇最佳提取時間為40 min。

2.1.4 超聲溫度

設定料液比1 g ∶30 mL、乙醇濃度80%、超聲時間40 min，考察不同超聲溫度（30、40、50、60、70 ℃）對金銀花三萜提取率的影響，結果見圖1-D。40 ℃時提取率最高，超過此溫度提取率下降，可能溫度升高會影響三萜穩定性，故選擇40 ℃為最佳提取溫度。

2.2 響應面法優化金銀花三萜提取工藝

2.2.1 不同因素對提取效果的影響

采用Design-Expert 8.0.6軟件得到擬合模型：

y=3.693 00+0.154 08A-0.120 08B+0.073 417C+0.121 75D-0.100 25AB+7.500 00E-004AC+0.059 750AD-0.054 000BC-0.081 500BD-0.045 000CD-0.467 75A2-0.444 00B2-0.083 500C2-0.135 50D2。

對擬合模型進行方差分析，結果見表3。由表3可以看出，回歸模型極顯著（P<0.000 1），而誤差項不顯著，說明回歸方程與實際情況吻合較好，試驗誤差小，因此可用該回歸方程代替試驗真實點對試驗結果進行分析。

決定系數R2和調整決定系數Adj R2分別為0.974 3和0.948 6，說明該模型擬合度良好;預測決定系數Pred R2為 0.873 7，說明該模型預測性良好。方程中A、B、C、D、A2、B2、D2對響應值影響極顯著，料液比A、乙醇濃度B、提取溫度D對提取率影響最顯著，其次為超聲時間C。AB交互作用顯著，說明不同提取條件與金銀花總三萜提取率之間不是簡單的線性關系。

2.2.2 各因素交互作用分析

圖2是采用Design-Expert 8.0.6軟件繪出的響應面及等高線圖。等高線的形狀反映交互效應的強弱，圓形表示兩因素交互作用不顯著，而橢圓形則表示兩因素交互作用顯著。從響應面等高線的分布規律和間隔距離可以看出因素間交互作用的強弱和因素對響應值的影響程度[16]。圖2表明料液比與乙醇濃度之間交互作用最顯著，對金銀花三萜的提取率影響最大。

2.2.3 最佳條件的確定及驗證試驗

用Design-Expert 806軟件得出金銀花總三萜提取最優條件為：料液比 1 g ∶31.1 mL，乙醇濃度75.4%，超聲時間47.8 min，超聲溫度 45 ℃，為適應試驗操作調整為：料液比1 g ∶30 mL，乙醇濃度75%，超聲時間50 min，超聲溫度45 ℃。此條件下進行5次驗證試驗，平均提取率為3.71%，達到預測提取率（3.77%）的98.4%，說明應用響應面法優化了金銀花總三萜的超聲輔助提取工藝，且金銀花中三萜類物質含量較高。

2.3 抑菌試驗結果

金銀花總三萜抑菌試驗結果見表4。對所選7種常見致病菌的最小抑菌濃度（MIC）范圍在3～24 mg/mL，整體抑菌作用較強，尤其是對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌抑制作用最強。

2.4 抗氧化試驗結果

DPPH和ABTS自由基清除試驗結果顯示，金銀花總三萜系列溶液濃度分別為3、6、12、24、48、96 mg/mL，對應的DPPH清除率分別為24.3%、36.8%、45.6、49.7%、53.2%、55.8%，對應的ABTS清除率分別為27.5%、39.6%、48.3%、51.3%、

59.7%、62.8%，表明金銀花總三萜具有一定的清除自由基的能力，清除率50%即IC50所對應濃度分別為26.1 mg/mL和18.8 mg/mL，且清除能力隨總三萜含量增加而增強，呈現出良好的劑量效應關系。

3 結論與討論

中藥功能活性成分復雜，其療效多是由多成分、多靶點、多效應綜合作用的結果，加之金銀花總三萜含量、提取工藝及抗菌、抗氧化活性至今未見報道，因此，本試驗選擇總三萜作為金銀花有效成分的提取指標。提取工藝的優劣能直接影響生藥的利用率及后期加工的難易，提取工藝的研究是中藥生產實現現代化的關鍵環節。

超聲波提取法近年來迅速發展。超聲波能增大物質分子運動頻率和速度，增加溶劑穿透力，提高藥物成分溶出速度和溶出數量，因此與常規方法比較，超聲波法提取效果好、對有效成分破壞少[17]。提取料液比、提取溫度、提取溶劑、提取時間等是影響藥物有效成分提取率的關鍵因素，要得到最佳提取工藝須要進行大量的試驗研究，響應面法是優化提取工藝時常采用的方法。

本研究應用響應面法優化金銀花總三萜的超聲輔助提取工藝，確定的最佳提取工藝參數為：料液比1 g ∶30 mL、乙醇濃度75%、超聲時間50 min、超聲溫度45 ℃，此條件下得到三萜提取率為3.71%，與其他中藥相比，金銀花中總三萜含量較高，且表現出了較強的抗菌活性和一定的抗氧化活性，說明在產量及活性方面金銀花三萜都具有進一步研究開發的價值;加之試驗值與理論值大致相同，說明該工藝省時省力、科學性強，具有較強的實際應用價值。本研究為進一步研究金銀花三萜化合物、提高金銀花資源綜合開發利用提供試驗依據。

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