糖對蓮藕實生苗不定根形成及過氧化物酶活性的影響

劉慧穎 韓玉燕 蔣潤枝 程立寶

摘要：利用不同濃度蔗糖、葡萄糖、果糖溶液處理蓮藕實生苗，研究不同糖處理對蓮藕實生苗不定根形成和過氧化物酶（POD）活性的影響。結果表明10、20、30 g/L蔗糖處理的實生苗均能促進蓮藕不定根的形成，而50 g/L的蔗糖具有明顯的抑制作用。利用10、20、30 g/L葡萄糖處理的蓮藕實生苗與對照相比無明顯變化，40 g/L和50 g/L的葡萄糖對不定根發生起明顯抑制作用。利用10、20、30、40、50 g/L的果糖處理蓮藕實生苗，前期與對照相比無明顯變化，后期隨著果糖溶液濃度的升高，對不定根的形成具有抑制作用。利用不同濃度蔗糖處理蓮藕實生苗，觀察POD活性的變化，結果表明不同濃度蔗糖處理過的蓮藕實生苗POD活性在0～8 d均呈現先下降后上升再下降的趨勢?？傊煌愋偷奶怯绊懮徟簩嵣绮欢ǜ男纬尚Ч煌?，這為進一步挖掘調控蓮藕不定根形成的機制奠定了堅實的理論基礎。

關鍵詞：糖類;蓮藕;不定根;過氧化物酶;實生苗

中圖分類號： S645.101 ?文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）16-0155-04

收稿日期：2019-01-16

基金項目：江蘇省農業科技自主創新資金[編號：CX（18）3066];江蘇省和揚州大學“研究生培養創新工程”項目（編號：XSJCX18_070）。

作者簡介：劉慧穎（1994—），女，江蘇泰州人，碩士研究生，主要從事蓮藕生長發育調控機制的研究。

通信作者：程立寶，博士，副教授，主要從事蔬菜遺傳育種與分子生物學。

蓮藕（Nelumbo nucifera Gaertn）是睡蓮科（Nymphaeaceae）蓮屬多年生水生草本植物[1]，種質資源豐富[2]。原產于印度，后來引入中國，是我國栽培面積最大的水生蔬菜[3]。以膨大根狀莖（俗稱藕）供食用，且藥用價值相當高，深受廣大人民的喜愛，是我國主要出口創匯型蔬菜之一[4]。蓮藕的根有2種，一種是主根，另一種是不定根。主根是蓮子播種后，由種子的胚根所形成的，但主根不發達，不定根直接影響蓮藕植株的生長發育。蓮藕不定根較多，發達的不定根不僅起到固定、支持植物的作用，還能從土壤中吸收植物生長發育必需的水分和無機鹽。糖起到提供營養成分和信號分子的雙重作用，且與植物激素作用影響根系生長發育[5]。

糖類又稱碳水化合物，是多羥基醛或多羥基酮及其縮聚物和某些衍生物的總稱[6]，一般由碳、氫與氧3種元素所組成[7]，是植物體內重要的碳源和能源[8]，它不僅參與能量代謝，還調控植物的生長發育和生理過程，糖類在種子萌發、生根、發育等方面都有舉足輕重的作用[9]。

蔗糖為等量的葡萄糖和果糖結合而成，是植物體內碳水化合物運輸的主要形式，也是光合作用的主要產物，有儲藏、積累和運輸糖分的作用。蔗糖在體內能被充分氧化分解產生CO2和H2O，并提供能量，是生物重要的碳源和能量提供者，同時蔗糖是生物細胞、蛋白質等的必需組成成分，因此它在生物的生長發育、代謝生理和繁殖等過程中發揮著重要的作用[10]。葡萄糖易溶于水，是自然界中最為重要且分布最廣的一種單糖，在植物的生長與干物質的積累方面具有積極作用[11]，也是新陳代謝中間產物和活細胞的能量來源，植物可通過光合作用產生葡萄糖[12]。果糖是葡萄糖的同分異構體，它能與葡萄糖結合生成蔗糖[13]。

過氧化物酶（POD）是活性較高的一種酶，大量存在于植物體內，在植物生長發育過程中它的活性不斷發生變化，參與呼吸作用和光合作用，同時與生長素代謝密切相關[14]。我們前期證明了生長素是蓮藕不定根形成的直接調控者，所以本試驗在研究蔗糖、葡萄糖和果糖對蓮藕實生苗不定根形成影響的基礎上，進一步探討了蔗糖處理對蓮藕植株POD活性的影響，為進一步探究糖及激素調控蓮藕不定根形成的機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為蓮藕品種太空蓮36號，由揚州大學園藝與植物保護學院提供。

試驗儀器主要有離心機和酶標儀;試劑主要有過氧化物酶（peroxidase，POD）試劑盒。

1.2 糖對蓮藕實生苗不定根形成的影響試驗

將蓮藕種子放置于RXZ-300D智能人工氣候箱（浙江寧波東南儀器有限公司制造）中培養，白天溫度設為30 ℃，夜間溫度設為24 ℃，濕度設為70%;待蓮籽充分吸水（2片子葉有裂縫）破殼后，選取長勢相似的實生苗放置于塑料盒（長22 cm×寬15 cm×高16 cm）中。該試驗于2017年10月開展。利用不同濃度的蔗糖、葡萄糖和果糖（表1）處理蓮藕實生苗3 d后換清水培養，每個處理設置3個重復，每個重復50株實生苗，2 d更換1次清水。

1.3 蓮藕實生苗不定根數量的測定

待蓮藕實生苗長出不定根之后，統計根長≥0.5 mm的所有實生苗不定根數量，計算生根率：生根率=生根種子數/種子總數×100%。

1.4 POD活性測定

采用過氧化物酶試劑盒測定樣品中過氧化物酶的活性（蘇州科銘生物技術有限公司提供）。按照提取液體積（mL） ∶組織質量（g）為10 ∶1的比例，在1 mL提取液中加入0.1 g混合樣品的，進行冰浴勻漿，在4 ℃下10 000 g離心機上離心10 min，提取上清，放置冰上待測。測定步驟如下：

（1）將酶標儀或分光光度計預熱30 min以上，調節波長至470 nm，蒸餾水調零。

（2）將試劑一、試劑二、試劑三在測定前室溫放置10 min以上，然后進行表2所示操作;在96孔板或微量石英比色皿中按順序依次加入表2中試劑，并立即混勻計時，在470 nm下記錄30 s和90 s的吸光度D1、D2。

（3）POD活性的計算。單位定義：在1 mL反應體系中 1 g 組織1 min D470 nm變化0.005為1個酶活力單位。

POD（U/g）=V總×ΔD÷（V樣×m÷V提）÷0.005÷T=4 000×ΔD÷m。

式中：V總為反應體系總體積，mL;V樣為加入樣本體積，mL;m為樣本質量;V提為加入提取液體積，mL;T為反應時間，min;ΔD=D2-D1。

1.5 數據分析

試驗數據采用SPSS 16.0軟件中One-Way ANOVA、Excel分析Duncans法（P<0.05）進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 蔗糖對蓮藕實生苗不定根形成的影響

2.1.1 不同濃度蔗糖處理對蓮藕實生苗不定根數量的影響 利用不同濃度的蔗糖溶液（10、20、30、40、50 g/L）處理蓮藕實生苗，結果（圖1）表明，低濃度的蔗糖處理在調查天數內顯著增加實生苗不定根數量，其中20 g/L的蔗糖處理效果顯著好于10、30、40、50 g/L的處理。研究發現在1～6 d，20 g/L和30 g/L的蔗糖處理蓮藕實生苗后，不定根形成數量均顯著高于清水對照，而10 g/L蔗糖處理在前期促進作用不明顯，后期促進效果逐漸增強;40 g/L蔗糖的處理在1～6 d內不定根形成的數量與對照相比無明顯差異，而50 g/L的濃度顯著抑制蓮藕實生苗不定根的形成。以上結果表明，低濃度蔗糖促進蓮藕實生苗不定根的發生，而高濃度的蔗糖起到抑制作用。

2.1.2 蔗糖對蓮藕實生苗不定根生根率的影響

由表3可見，不同濃度的蔗糖對蓮藕實生苗生根率的影響不同，與其他濃度的蔗糖處理和對照對比，10 g/L蔗糖溶液處理后實生苗生根效果最好，在6 d時生根率已達97%。20、30、40 g/L蔗糖的處理，在1～6 d時不定根生根率也顯著高于對照。50 g/L 蔗糖處理實生苗后，不定根生根率顯著低于對照。上述結果表明，低濃度的蔗糖加速不定根的形成，而高濃度的蔗糖延緩了不定根的形成過程。

2.2 葡萄糖對蓮藕實生苗不定根形成的影響

2.2.1 葡萄糖對蓮藕實生苗不定根形成數量的影響 由圖2可見，利用同濃度的葡萄糖處理蓮藕實生苗，在處理后的 1～6 d，10 g/L和20 g/L的處理與對照相比，不定根數量無明顯變化，40 g/L和50 g/L的葡萄糖顯著抑制了蓮藕不定根形成的數量。30 g/L葡萄糖的處理在1～4 d時，與對照相比無顯著變化，在5～6 d時，不定根形成數量顯著少于對照。綜上所述，低濃度葡萄糖對蓮藕實生苗不定根的發生無明顯作用，而高濃度葡萄糖具有顯著的抑制效果。

2.2.2 不同濃度的葡萄糖對蓮藕實生苗不定根生根率的影響

蓮藕實生苗在不同濃度葡萄糖處理下，其生根率如表4所示，處理后1～4 d，與對照相比，10、20、30、40 g/L處理下的實生苗不定根發生率無明顯變化，而濃度達到50 g/L時，不定根的發生明顯變遲緩。處理后5～6 d，除5 d時50 g/L處理外，各個處理和對照之間不定根發生率差異不顯著。

2.3 果糖對蓮藕實生苗不定根形成的影響

2.3.1 果糖對蓮藕實生苗不定根形成數量的影響

利用10、20、30、40、50 g/L的果糖處理蓮藕實生苗，研究其對蓮藕實生苗不定根形成數量的影響。結果（圖3）表明：在1～6 d時，10 g/L 和20 g/L的果糖對蓮藕實生苗不定根的形成與對照相比無顯著差異。30 g/L和40 g/L的果糖在1～4 d時與對照相比變化不明顯，在5～6 d時，不定根數量顯著低于對照。50 g/L果糖顯著抑制了不定根的發生，在1～6 d時不定根數量明顯低于對照。

2.3.2 果糖對蓮藕實生苗不定根生根率的影響

蓮藕實生苗在不同濃度果糖處理下生根率的變化如表5所示，10、20、30、40、50 g/L的果糖處理后，生根率在1～2 d時均高于對照，在3～6 d時，不同濃度果糖溶液處理過的蓮藕實生菌不定根生根率與對照相比均無明顯變化。

2.4 蔗糖對蓮藕不定根POD活性的影響

由圖4可知，不同濃度蔗糖處理的蓮藕實生苗不定根POD活性在0～8 d均呈現先下降后上升再下降的趨勢。0 d時，30 g/L蔗糖處理下的蓮藕實生苗POD活性最高，與 20 g/L 和40 g/L處理的差異不顯著，但均顯著高于對照。在2 d時，所有濃度蔗糖處理的實生苗POD活性均高于對照組，且40 g/L>30 g/L>20 g/L>50 g/L>10 g/L。處理后8 d，10 g/L 和20 g/L的蔗糖處理顯著高于對照及其他處理，其他濃度蔗糖處理之間差異不顯著。

3 結論

本研究發現，20 g/L蔗糖溶液能夠顯著提高蓮藕實生苗不定根數量和生根率，而50 g/L蔗糖對不定根形成的數量和生根率起到顯著的抑制作用。低濃度的葡萄糖對不定根形成無明顯作用，而高濃度的葡萄糖和果糖顯著抑制了不定根的發生;低濃度的果糖雖然對不定根數量沒影響，但加速了不定根的發生時間。蔗糖處理后蓮藕實生苗POD活性呈現先下降后上升再下降的趨勢。

4 討論

Takahashi等已發現，蔗糖、葡萄糖和果糖可以明顯促進擬南芥下胚軸不定根的發生[15]。耿貝貝等研究表明低濃度蔗糖（1 g/L）可以誘導黃瓜不定根發生，而高濃度蔗糖（5～50 g/L）則不同程度抑制不定根的發生[16]。本試驗結果與之一致。胡江琴等報道高于5 g/L的蔗糖（20～120 g/L）對綠豆下胚軸不定根發生有不同程度的抑制作用[17];但在丹參上觀察到高濃度蔗糖（60 g/L）反而有利于不定根生長[18]。黃韜等在對人參不定根培養的研究中發現40 g/L的蔗糖最有益于人參不定根的生長，當蔗糖濃度比較低時，不定根的生長狀態較差，高濃度的蔗糖卻對不定根的生長有一定的促進作用[19]。本研究發現，低濃度蔗糖（10～30 g/L）可以誘導蓮藕不定根形成，而高濃度蔗糖（40～50 g/L）則不同程度抑制了不定根的發生。葡萄糖和果糖在低濃度（10～30 g/L）無營養條件下對蓮藕不定根的形成數量無明顯影響，高濃度起抑制作用（40～50 g/L）。本試驗結果與耿貝貝等人試驗結果相似，與黃韜等人研究結果有出入，說明不同類型的糖對不同物種的作用可能不同。

POD參與了植物生長發育的全過程，隨著物種種類和生長發育階段等不同，POD活性會發生變化。韓晴在對槐種子發育過程的研究中發現，在花后60～90 d，種子葉細胞過氧化物酶活性從低到高，然后又呈現降低的變化趨勢[20]，本試驗結果與之相似，我們利用蔗糖處理蓮藕實生苗，發現在0～8 d內POD活性呈現先下降后上升再降低的規律，說明蓮藕實生苗不定根POD活性可能與蔗糖濃度有關。研究表明生長素調控了蓮藕不定根的形成[21]，而POD活性與生長素代謝密切相關，所以過氧化物酶可能通過影響蓮藕實生苗中生長素含量，進而影響不定根的發生。

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