異硫氰酸芐酯納米乳液射流空化制備與凍融穩定性研究

田 甜 周 艷 高 悅 李 楊,2 王中江 李 良

(1.東北農業大學食品學院， 哈爾濱 150030; 2.哈爾濱食品產業研究院， 哈爾濱 150028)

0 引言

異硫氰酸芐酯(BITC)是蔬菜抗癌作用的主要生物活性物質[1]。文獻[2]的流行病學研究表明，BITC可以作為有效的抗菌劑，并作為傳統抗生素更安全、更有效的替代品。因為BITC具有強烈的揮發性、易降解、水溶性差、生物利用度低等缺點，目前缺乏適當的補充機制[3]。

納米乳液是指粒徑在20～500 nm之間的一種營養物運輸體系。與一般乳液相比，納米乳液對體系的物理化學穩定性和所運載營養物質的體內吸收起到增強效果[4]。吐溫、司盤等小分子表面活性劑可作為納米乳液乳化劑，但其存在一定安全隱患，目前大多使用天然表面活性劑作為乳化劑，其中大豆分離蛋白因其高營養價值及較高的乳化性而被廣泛應用于食品加工中[5-6]。大豆分離蛋白受其結構影響，其乳化性等功能性質不能滿足納米乳液制備要求，因此加入磷脂酰膽堿，以增強其乳化性。同時，利用射流空化技術產生的空穴效應使蛋白的柔性結構及二級結構發生變化，降低乳液的粒徑，提高乳液的穩定性[5]。射流空化是一種新型加工技術，利用液體在U型管中快速流動并形成靜脈收縮，使附近壓力下降，形成數百萬個空腔，隨著液體膨脹，壓力恢復導致空腔坍塌，以高幅度壓力脈沖釋放能量，得到儲藏穩定性高、粒徑小、易于被人體吸收的乳液。與一般高能乳化方法相比，它是產生空化作用力最便宜和最節能的方法之一，且用于產生空化的設備很簡單，系統規模擴大相對容易[7]。

納米乳液通常通過冷凍保存，可以有效限制微生物生長和化學降解反應[8]。然而，許多乳液在冷凍時非常不穩定，解凍時易造成營養物質分解[8-9]。文獻[10]研究發現，超高壓均質能顯著增強納米乳液凍融穩定性；文獻[11]利用高壓均質改變大豆蛋白二級結構，繼而增加其與葡聚糖的交聯作用，改善了納米乳液的凍融穩定性。

本文以大豆蛋白-磷脂作為表面活性劑，以BITC與大豆油混合物作為油相，采用射流空化技術制備納米乳液，探究射流空化對納米乳液形成與凍融穩定性的影響，以期為工業生產提供理論支撐，擴大其在食品行業的應用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆分離蛋白，山東禹王有限公司；異硫氰酸芐酯(BITC)、磷脂酰膽堿，索萊寶公司；吐溫80、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉等化學試劑均為國產分析純級。

1.2 儀器與設備

ULTRA-TURRAX UTL2000型乳化機，德國IKA儀器設備公司；射流空化機，北京華瑞創世科技有限公司；Zetasizer Nano-ZS 90型粒度分析儀，英國馬爾文公司；UV755B型紫外分光光度計，上海菁華科技儀器有限公司；Delta Vision OMX SR型光學顯微鏡，美國通用電氣公司；PerkinElmer DSC8000型差示掃描量熱儀，珀金埃爾默企業管理(上海)有限公司；PHSJ-4A型實驗室pH計，中國上海雷磁公司；FA2004B型電子分析天平(精度0.000 1 g)，北京賽多利斯儀器系統有限公司。

1.3 方法

1.3.1粗乳液制備

將大豆蛋白(1.5%)和磷脂酰膽堿(0.2%)溶于磷酸鹽緩沖液(pH值7.0、0.01 mol/L)中，室溫(25℃)下連續攪拌2 h以致完全溶解，然后加入疊氮化鈉(0.01 g/(100 mL))以抑制微生物生長，把大豆油(10%)分散到水相中，用高速分散器以轉速10 000 r/min均質2 min，形成粗乳液[12]。

1.3.2BITC納米乳液射流空化制備工藝

將粗乳液通過射流空化機進一步均質乳化即得大豆蛋白-磷脂酰膽堿BITC納米乳液。分別取1.3.1節制備的適量粗乳液于燒杯中，置于射流空化機中，分別在射流空化壓力0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 MPa條件下射流空化處理10 min，以循環冷熱水控制射流空化溫度，在相應工藝條件下制備BITC納米乳液[13]。

1.3.3凍融處理

將制備得到的乳液立即進行凍融處理。取不同的乳液樣品20 mL裝入塑料容器中，在-20℃的冰箱中恒溫貯存24 h，將冷凍后的樣品在20℃水浴中解凍，取部分樣品保持20℃不變并進行分析。再將解凍的乳液置于-20℃冰箱中恒溫貯存24 h，進行第2次凍融循環，將凍融過程重復3次，并在每次凍融后測量乳液的凍融穩定性[14]。

1.3.4粒徑測量

用Zetasizer Nano-ZS 90型光散射粒度分析儀分別測定經過凍融循環的乳液粒徑分布規律。參數設定：BITC油滴的折射率為1.460，水相溶液折射率為1.330，為降低多重光散射效應，分析前用磷酸鹽緩沖液(pH值7.1，0.01 mol/L)稀釋BITC納米乳液1 000倍測粒徑及PDI(聚合物分散性指數，用于描述聚合物分子量分布)，稀釋50倍測ζ-電位[15]。

1.3.5乳層析指數

借鑒文獻[16]的方法并略加修改。納米乳液在每次凍融循環后，分成上下兩層。記錄乳狀液所在具塞比色管底部清液層的高度Hs和乳液的總高度HT。乳液的乳層析指數CI表示為

1.3.6出油率

借鑒文獻[17]的方法并略加修改。采用染料稀釋法確定凍融后乳液油脂釋放量，蘇丹Ⅲ油溶液制備：室溫下準確稱量0.001 5%的蘇丹Ⅲ染液與大豆油混合，磁力攪拌12 h，使蘇丹Ⅲ完全溶解。以大豆油為空白對照，選擇波長為508 nm測定蘇丹Ⅲ油溶液的吸光度A1，得到標準曲線。將4 g蘇丹Ⅲ油溶液與16 g凍融處理后的乳液樣品混合均勻，靜置60 min后1 000g離心20 min。用移液槍等量吸取乳狀液頂部1.5 mL油狀物，在高速離心機15 000g條件下離心20 min。取上清液在508 nm波長處測定吸光度A2，出油率計算公式為

其中a=A1/A2

式中φe——乳狀液中脂肪質量分數，%

M0——蘇丹Ⅲ染液質量，g

Me——乳狀液樣品質量，g

1.3.7乳液顯微結構

將經過凍融循環的乳液勻速攪拌30 s，使其保持均勻，吸取20 μL BITC納米乳液滴于載玻片中心，蓋上蓋玻片，注意不要產生氣泡，將載玻片置于載物臺上觀察，先在10倍物鏡下找到清晰的視野，然后在40倍物鏡下放大40×40倍率進行乳液液滴外貌觀察。

圖1 凍融后射流空化壓力對納米乳液平均粒徑和PDI的影響Fig.1 Effect of jet-cavitation pressure of different jets on average particle size and PDI of nanoemulsion after freeze-thaw

1.3.8差示掃描量熱法(DSC)

每個乳液樣品制備完成后立即用移液器移取，用電子分析天平準確稱量5～10 mg至TAQ20型液體鋁坩堝，然后蓋上配套的鋁蓋壓盤密封，樣品盤放置在DSC爐腔外側電極，內側放置相同質量的磷酸鹽緩沖溶液的密封鋁盤作對照。熱分析通過雙循環模型進行，掃描范圍為-40～40℃，10℃/min，氮氣流速25 mL/min，每個乳液樣品至少作兩次平行重復試驗，測得的DSC數據包括結晶或融化過程的起止溫度、頂點溫度和熱焓變(DH)[18]。

1.4 統計分析

所有試驗重復3次取平均值，結果表示為平均值±標準差。采用SPSS 20.0進行數據處理和分析，使用Origin 9.0軟件制圖。

2 結果與分析

2.1 平均粒徑和PDI

平均粒徑是衡量納米乳液穩定性的關鍵指標，一般來說，乳液的液滴平均粒徑越小，乳液越穩定[19]，PDI表征聚合物分子量分布，PDI值越小，說明乳液體系中粒徑分布越均勻，液滴分散性越好[20]。凍融循環對乳液液滴平均粒徑和PDI的影響如圖1所示。隨著射流空化壓力的增大，乳液平均粒徑及PDI呈顯著下降趨勢，經過3次凍融循環后納米乳液粒徑及PDI顯著增大，未經射流空化處理的乳液凍融穩定性最差，第2次凍融后乳液出現絮凝現象，這是由于冷凍處理使溶液形成不規則冰晶，易刺穿液滴界面膜，小油滴很容易從界面層滲透出來接觸聚結成大油滴，破壞乳液的凍融穩定性[21]。當壓力增至0.8 MPa時，凍融循環對納米乳液粒徑((252±6.2) nm)及PDI值(0.114±0.034)影響顯著減小，乳液凍融穩定性最強，這是因為射流空化產生的壓力提高了蛋白表面的離子集團數和蛋白的水合力，提高了蛋白-磷脂乳化體系的穩定性，而且射流空化處理增加了蛋白的乳化性能，能夠在油滴表面快速形成更加致密的界面膜，使乳液在冷凍條件下形成的脂肪晶體或冰晶很難破壞界面膜，有效減少了油滴之間的聚集和凝結現象產生，這與文獻[22]研究結果一致。且隨著射流空化壓力的繼續增加，乳液穩定性降低，這是由于過高壓力可能導致乳液液滴裂解而出現油-水界面失穩現象，表現為平均粒徑升高。文獻[23]研究發現，均質壓力過高會導致大豆蛋白相對分子質量變大， 這也可能是粒徑及PDI 增大的原因。

2.2 ζ-電位

乳液的表面電荷密度能有效反映液滴之間的靜電相互作用，ζ-電位絕對值越高乳液越穩定。如圖2所示，納米乳液具有相對高的負表面電位，這可歸因于溶液pH值高于吸附的大豆蛋白的等電點[24]。在pH值7.0的緩沖溶液中，未經射流空化處理的納米乳液ζ-電位為-12.45 mV，隨著射流空化壓力增加，乳液整體電位絕對值呈現先升高后降低的趨勢，經0.8 MPa射流空化處理的納米乳液ζ-電位為(-27.2±0.6) mV，表面電荷密度最大。結合乳液粒徑和微觀結構分析，此時乳液的穩定性最好，這是因為射流空化改變乳液中蛋白質-磷脂復合物的組成和結構，使乳液界面性質發生改變，間接增加了乳液的表面電荷[24]。文獻[25]研究發現，空化處理使大豆分離蛋白的二級結構發生改變，蛋白質結構伸展進而促進其與磷脂之間的相互結合，造成乳液表面電荷的增加，同時磷脂增加蛋白質的乳化效率，減少界面層的解析現象，使乳液的穩定性進一步提高。經凍融循環后乳液的電位絕對值都有所下降，凍融穩定性也顯著降低，這是因為凍融處理使蛋白分子從乳液中解析，蛋白質的乳化效率下降，同時凍融處理使乳液表面電荷減少導致油滴之間相互排斥形成聚集[26]。

圖2 凍融后射流空化壓力對納米乳液ζ-電位的影響Fig.2 Effect of different jet-cavitation pressure on ζ-potential of nanoemulsion after freeze-thaw

2.3 乳液顯微結構

光學顯微鏡可以直觀地表征乳液顆粒大小、分散狀況及凍融處理產生的不穩定現象。由圖3可知，由射流空化處理的樣品均具有納米尺寸的球狀液滴，乳液經第1次凍融后，納米乳液凍融穩定性變差，乳液液滴大小不均且出現聚集現象，3次凍融后乳滴成片聚集，這是由于乳液冷凍過程中部分未形成冰晶的液相相互聚集，且冷凍處理使大豆蛋白結構變性，蛋白乳化性等功能性質降低，油-水界面膜強度減弱，加劇了油滴之間的聚集。隨著射流空化壓力增加，大豆蛋白與磷脂形成的復合乳液粒徑較小，文獻[27]研究發現，超高壓均質產生的高速剪切作用力能顯著降低乳液粒徑直徑，并增強乳液的溶解度。當射流空化處理壓力為0.8 MPa時，液滴粒徑最小且分布均勻，表面活性劑完全覆蓋油滴表面，乳液凍融穩定性增強，這是因為射流空化使大豆蛋白柔性結構發生改變，蛋白-磷脂結構更為致密，不易被油晶和冰晶破壞。空化壓力過大時，蛋白-蛋白、蛋白-磷脂之間的交聯程度過高，大豆蛋白乳化能力下降，乳液體系油體積面積增大，顯微鏡呈現相對較大的顆粒[28]。

圖3 凍融后射流空化壓力對納米乳液顯微結構的影響Fig.3 Effect of jet-cavitation pressure on microstructure of nanoemulsion after freeze-thaw

2.4 乳層析指數

通過測定乳狀液的乳層析指數反映乳狀液的穩定性，如圖4所示，乳液經凍融處理后，乳層析指數增加，是因為冷凍使乳液中的水分和油脂形成晶體，刺破油脂表面較薄的界面膜，小分子油滴聚集成大分子油滴，且隨著凍融次數增多，乳液的聚集程度更顯著。較未處理乳液相比，乳液的乳層析指數隨著射流空化壓力的增加而降低，其中射流空化壓力為0.8 MPa的納米乳液乳層析指數比未處理樣品的乳層析指數降低了51.39%。這可能是由于射流空化處理產生的超高速剪切力及空化作用力改變了蛋白質的柔性結構，表面電荷增多進而穩定性提高，也有可能是射流空化處理使蛋白質表面疏水基團暴露，使其更易吸附在油滴表面抵抗冷凍對界面穩定性的破壞[29]。

圖4 凍融后射流空化壓力對納米乳液乳層析指數的影響Fig.4 Effect of jet-cavitation pressure on emulsion index of nanoemulsion after freeze-thaw

2.5 出油率

由表1可知射流空化處理及凍融循環對大豆蛋白-磷脂乳狀液出油率的影響。隨著凍融次數增多，乳狀液的出油率增大，乳液的凍融穩定性逐漸降低，這是因為乳液冷凍過程中形成冰晶，界面膜遭到破壞，小分子油滴逐漸聚集，且冷凍處理使大豆蛋白過度交聯，蛋白乳化能力下降，與磷脂之間的相互作用降低導致乳液界面強度下降。隨著射流空化處理壓力增加，乳液的出油率呈顯著下降趨勢(P<0.05)，當射流壓力增加至0.8 MPa時，乳液出油率較未處理樣品下降83.64%，乳液呈現較好的凍融穩定性，這是因為空化處理提高了蛋白質的乳化性能，蛋白的界面吸附能力得到改善，增強了界面強度。文獻[30]利用超聲提高大豆分離蛋白乳化性，文獻[31]發現高壓均質對豆類蛋白質乳化活性和乳化穩定性具有改善作用。但當射流空化處理壓力過大，交聯程度過高時，蛋白質乳化能力下降，油滴從界面膜內解析出來與其他物質混合形成聚集，乳液的出油率略有增長。

表1 凍融后射流空化壓力對納米乳液出油率的影響Tab.1 Effect of jet-cavitation pressure on oil yield of nanoemulsion after freeze-thaw %

注：同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.6 差示掃描量熱分析

通過差示掃描量熱法(DSC)可以研究乳液油、水結晶對凍融穩定性的影響，在一定條件下，乳液體系可能有一相出現結晶，也可能兩相均出現結晶，這取決于水、油兩相凝固點。研究發現大豆油的凝固點約為-17℃，SPI凝固點約為-16.5℃，水相和油相凝固點均高于試驗冷凍溫度(-20℃)，圖5顯示了乳液凍融的熱譜圖，在冷凍過程中，乳液出現結晶峰，凝固點在-19.3～-18.7℃之間，表明在-20℃冷凍條件下，未處理乳液及射流空化乳液均形成結晶，所以納米乳液凍融穩定性差是由冷凍過程中冰晶破壞乳液界面平衡造成的。未處理乳液凍融過程中，其在 6℃左右會觀察到一個比較明顯的放熱峰，這表明乳液中存在游離脂肪，原因是由于油滴刺破界面膜形成聚集[32]，而射流空化處理的乳液在6℃左右出現較緩的放熱峰，隨著空化壓力增加，放熱峰變緩，這說明射流空化能顯著改善凍融處理對乳液穩定性的影響。

圖5 凍融后射流空化壓力對納米乳液DSC的影響Fig.5 Effect of jet-cavitation pressure on nanoemulsion DSC after freeze-thaw

3 結束語

射流空化對大豆分離蛋白-磷脂的改性可以提高其乳液體系的凍融穩定性。經過3次凍融后，經射流空化的納米乳液凍融穩定性顯著高于未處理乳液。當射流空化壓力為0.8 MPa時，乳層析指數和出油率分別比未處理乳液降低了51.39%、83.64%，相較于傳統大豆分離蛋白乳化體系，經射流空化處理的乳液凍融穩定性得到很大提高。射流空化技術產生的高速剪切力會改變大豆分離蛋白柔性結構，使其與磷脂更好地交聯，形成堅韌的界面膜，減弱凍融作用對乳液熱特性的影響，乳液在3次凍融后蛋白沒有明顯的橋聯絮凝現象，油滴依然被緊密地包裹在界面膜中，表現出較好的凍融穩定性。