外源添加物對桑椹果酒高級醇的影響

孫時光，左勇，徐佳，易媛，郭紅莉

1(四川輕化工大學，四川 自貢，643000) 2(四川省五糧液集團有限公司，四川 宜賓，644000) 3(四川師范大學，四川 成都，610000)

桑椹果酒是以桑椹汁為原料經酵母發酵而成的一種低酒精度飲料[1]，不僅含有豐富的花青素、有機酸和類黃酮等營養物質，還具有補肝益腎、強身補血、抗衰老、抗氧化、降糖降脂等藥理作用[2-5]，被稱為果酒中的極品。桑椹果酒中含有多種風味物質，其中含量較為豐富的是其發酵副產物——高級醇。高級醇是具有3個及3個以上碳原子一元醇的總稱，在桑椹果酒中主要發揮呈香呈味的作用，對桑椹果酒的香氣與味道有重要的影響[6-7]。但高級醇含量過高則會使人的神經系統充血，引發頭疼，并且高級醇的毒性會因其含量的升高而增大[7-8]。因此，控制好桑椹果酒中高級醇的含量對提高桑椹果酒的品質具有重要意義。

目前，桑椹果酒高級醇研究主要集中在低產高級醇桑椹果酒專用酵母的選育、優化桑椹果酒低產高級醇的發酵條件和桑椹自身的果渣含量對桑椹果酒中高級醇含量的影響等方面，如孫時光等[1]從桑椹自然發酵醪中篩選出了可以取代葡萄酒酵母的低產高級醇桑椹果酒專用酵母；羅惠波等[9]通過響應面法優化了桑椹果酒的發酵工藝，降低了桑椹果酒中高級醇的含量；周青等[10]探究了不同果渣添加量對桑椹果酒中高級醇濃度的影響，確定了果渣的最佳添加量。但以外源添加物來控制桑椹果酒高級醇含量卻鮮有報道，本次實驗擬向桑椹汁和處于發酵期的桑椹果酒中添加酶制劑(果膠酶、糖化酶、纖維素酶)、金屬離子(Mg2+、Ca2+、K+)和可同化氮源(谷氨酸、精氨酸、丙氨酸、磷酸氫二胺)，分析其對桑椹果酒高級醇含量的影響，并通過響應面法得到最優的復配比，以期為控制桑椹果酒高級醇含量提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

S-2桑椹果酒專用酵母(本實驗室選育)[1]；桑椹(品種為無籽大十)，自貢市場；白砂糖，市售一級白砂糖；果膠酶、糖化酶、纖維素酶、MgCl2(分析純)、NaCl(分析純)、KCl(分析純)、(NH4)2HPO4(分析純)、L-谷氨酸(生化試劑)、L-精氨酸(生化試劑)、L-丙氨酸(生化試劑)，上海源葉生物科技有限公司；正丙醇(分析純)、異丁醇(分析純)、異戊醇(分析純)、乙酸丁酯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 儀器與設備

Agilent 6890N-5975B氣相色譜儀，美國Agilent公司；T6新世紀紫外可見光分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；GZ-250-HSⅡ恒溫恒濕培養箱，韶關廣智科技設備公司；HWS-122電熱恒溫水浴鍋，北京中興偉業儀器有限公司；YXQ-LS-75SII立式壓力蒸汽滅菌器，上海博訊實業有限公司。

1.3 方法

1.3.1 桑椹果酒發酵流程[1, 4,11]

操作要點：A：焦亞硫酸鉀加入量以桑椹汁中SO2的終濃度達到50 mg/L為準；B：加白砂糖調整糖度至21 Brix。C：接種酵母為預先活化的菌種，接種量為質量分數5%，在25 ℃發酵7 d。

1.3.2 酶制劑添加時間對桑椹果酒高級醇含量的影響

以0.2 g/L的添加量[12]將果膠酶、糖化酶和纖維素酶分別在桑椹果酒發酵0、1、2、3、4、5、6 d的時候加入到發酵液中，并在第7天發酵完成后檢測桑椹果酒中高級醇含量，選出酶制劑的最佳添加時間

1.3.3 酶制劑、金屬離子和可同化氮源的添加量對桑椹果酒高級醇含量的影響

酶制劑添加量：按照酶制劑的最佳添加時間，在桑椹果酒發酵過程中分別添加0.025、0.05、0.1、0.2、0.3 g/L的果膠酶、糖化酶、纖維素酶，在發酵完成后檢測桑椹果酒高級醇含量，探究酶制劑添加量對桑椹果酒酒精度、總酸和高級醇的影響。

金屬離子添加量[13-14]：在1.3.1的成分調整階段分別添加10、20、30、40、50 mg/L的MgCl2、CaCl2、KCl，在發酵完成后檢測桑椹果酒高級醇含量，探究金屬離子添加量對桑椹果酒酒精度、總酸和高級醇的影響。

可同化氮源添加量[8,13, 15]：在1.3.1的成分調整階段分別添加20、40、60、80、100 mg/L的谷氨酸、丙氨酸、精氨酸、(NH4)2HPO4，在發酵完成后檢測桑椹果酒中高級醇含量，探究可同化氮源添加量對桑椹果酒酒精度、總酸和高級醇的影響。

1.3.4 采用響應面法優化外源添加物的種類和含量

在1.3.3實驗結果的基礎上，采用Box-Behnken響應面設計法[16]，以桑椹果酒高級醇含量為響應值，選擇對桑椹果酒高級醇含量影響較強的3個外源添加物進行三因素三水平的響應面實驗，以獲得最佳降醇效果。

1.3.5 理化分析

乙醇體積分數的測定：采用分光光度計法[17]；總酸含量的測定：參照GB/T 15038—2006 葡萄酒、果酒通用分析方法[18]。

1.3.6 氣相色譜法測定高級醇

色譜條件：毛細管柱J&W 122-7062DB-WAX 60.0 m×0.25 mm×0.25 μm；進樣口溫度230 ℃，起始溫度45 ℃，保留2 min，以4 ℃/min升至120 ℃，保留2 min，以10 ℃/min升至230 ℃，保留3 min；載氣He，檢測器溫度230 ℃，恒流1.0 mL/min；進樣量1 μL。

樣品處理：取內標液(乙酸正丁酯)100 μL置于10 mL容量瓶中，用待測酒樣定容，然后用孔徑0.22 μm的濾膜過濾。取1 mL樣液加入到自動進樣瓶中，上機，進行氣相分析[19]。

1.4 數據處理

應用Origin 9.0軟件[20]對實驗中的柱狀圖進行繪制；應用SPSS 22軟件[21]對實驗數據進行相關性和顯著性分析；應用Design expert 8.0軟件[22]進行Box-Behnken響應面設計。每組實驗設3次平行。

2 結果與分析

2.1 發酵過程中不同酶制劑對高級醇含量的影響

桑椹果酒中的高級醇一般是由蛋白質與糖類物質的代謝產物轉化而成[23]，酶在其形成過程中起到關鍵性作用。本實驗從桑椹果酒發酵0 d開始直到發酵結束，每天依次向正在發酵的發酵液中加入酶制劑，探究不同酶制劑的添加時間對桑椹果酒高級醇含量的影響，結果見圖1～3。

圖1 糖化酶添加時間對桑椹果酒高級醇含量、酒精度與總酸含量的影響Fig.1 Effect of adding time of saccharification enzyme on the content of higher alcohols, alcohol and total acid in mulberry wine注：小寫英文字母、大寫英文字母和小寫希臘字母分別表示總高級醇含量、酒精度和總酸的差異顯著性；相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

圖2 果膠酶添加時間對桑椹果酒高級醇含量、酒精度與總酸含量的影響Fig.2 Effect of adding time of pectinase on the content of higher alcohols, alcohol and total acid in mulberry wine

圖3 纖維素酶添加時間對桑椹果酒高級醇含量、酒精度與總酸含量的影響Fig.3 Effect of adding time of cellulase on the content of higher alcohols, alcohol and total acid in mulberry wine

由圖1～3可以看出，不同時間添加的糖化酶，果膠酶和纖維素酶對桑椹果酒的總酸含量并無顯著影響，對酒精度雖有影響但酒精度均處于11% vol以上，屬于正常范圍。而酶制劑的不同添加時間對桑椹果酒高級醇含量產生了較大影響，在桑椹果酒發酵第1天后加入的3種酶制劑，均能顯著降低桑椹果酒高級醇的含量，阻礙高級醇的形成。故而選擇發酵第1天作為3種酶制劑的最佳添加時間。

2.2 酶制劑、金屬離子和可同化氮源的添加量對桑椹果酒高級醇含量的影響

2.2.1 酶制劑添加量對桑椹果酒高級醇含量的影響

酶制劑不但可以提高桑椹果酒的出汁率，加速桑椹果酒澄清，提高桑椹果酒發酵速率，而且可以在桑椹果酒發酵過程中控制高級醇的生成量，如糖化酶和纖維素酶可以提高桑椹果酒中被酵母直接利用的葡萄糖濃度，加速對糖分的代謝，減少對氨基酸的降解代謝，從而降低高級醇的生成量[24-25]；果膠酶不僅可以促進桑椹果酒澄清，還能控制高級醇的生成[26]。本次實驗探究了不同酶制劑的含量對桑椹果酒高級醇的影響。

由圖4可知，糖化酶添加量對總酸含量無顯著影響，酒精度隨著糖化酶添加量的增加而顯著升高，高級醇含量隨著糖化酶添加量的不斷增加呈現先下降后回升的趨勢，且糖化酶添加量為0.2 g/L時桑椹果酒高級醇含量最低，為310.53 mg/L，與未添加糖化酶相比高級醇降低了5.95%。這是因為糖化酶可以將淀粉轉化為酵母可以直接利用的葡萄糖，使酵母對糖分進行代謝從而減少對氨基酸的分解代謝，從而升高酒精度，降低高級醇含量。然而隨著糖化酶添加量的不斷增加，酵母可利用的糖分超過一定濃度后會通過糖合成代謝途徑合成異丁醇等高級醇，使總高級醇含量上升。

圖4 糖化酶添加量對桑椹果酒高級醇含量、酒精度與總酸含量的影響Fig.4 Effect of adding amount of saccharifying enzyme on the content of higher alcohols, alcohol and total acid in mulberry wine

由圖5可知，果膠酶添加量對桑椹果酒的酒精度與總酸含量無顯著影響，但添加果膠酶可以降低桑椹果酒高級醇含量，且呈現先上升后下降的趨勢。當添加量為0.05～0.2 g/L時可以有效降低桑椹果酒高級醇的含量，高級醇含量最低為303.55 mg/L，與未添加果膠酶相比，高級醇降低了6.74%，這可能是由于適量的果膠酶可以促進桑椹中糖浸提，促進酵母對糖的利用，減少氨基酸的降解，從而阻礙高級醇生成。然而果膠酶超過一定量會造成桑椹果酒中蛋白質含量增加，在發酵后期轉化為氨基酸，通過氨基酸降解途徑生成高級醇，使高級醇含量增加。

圖5 果膠酶添加量對桑椹果酒高級醇含量、酒精度與總酸含量的影響Fig.5 Effect of adding amount of pectinase on the content of higher alcohols, alcohol and total acid in mulberry wine

由圖6可知，纖維素酶添加量對桑椹果酒的酒精度與總酸含量無顯著影響。當纖維素酶添加量為0.2 g/L時降低桑椹果酒高級醇效果最佳，為296.14 mg/L，與未添加纖維素酶的對照組相比，高級醇含量降低了9.01%。纖維素酶降低桑椹果酒高級醇的機理與糖化酶類似，都是通過增加酵母可利用的糖濃度和減少氨基酸的降解代謝。且與糖化酶與果膠酶相比，纖維素酶對于桑椹果酒高級醇的抑制效果最好。

圖6 纖維素酶添加量對桑椹果酒高級醇含量、酒精度與總酸含量的影響Fig.6 Effect of adding amount of cellulase on the content of higher alcohols, alcohol and total acid in mulberry wine

2.2.2 金屬離子添加量對桑椹果酒高級醇含量的影響

金屬離子在桑椹果酒發酵過程中可以起到促進氧化、酯化、水解等作用，一定量的金屬離子可以提升桑椹果酒的品質。不同的金屬離子對桑椹果酒的作用也不同，如Mg2+是糖酵解途徑重要的輔助因子，是微生物體內多種酶的激活劑[27]；K+可以維持細胞內外滲透壓[28]；Ca2+對保護細胞膜結構和功能完整，穩定細胞壁結構，調節酶的活性等方面有著重要作用[29]。

圖7 Mg2+添加量對桑椹果酒高級醇含量、酒精度與總酸含量的影響Fig.7 Effect of adding amount of Mg2+on the content of higher alcohols, alcohol and total acid in mulberry wine

由圖7可知，隨著Mg2+含量的增加，總酸含量呈現緩慢上升的趨勢，高級醇含量呈現先下降后上升的趨勢，而酒精度呈現了先升高再降低的趨勢。這說明較低的Mg2+濃度對桑椹果酒中酒精的生成有一定的促進作用，但卻阻礙了高級醇的生成，當Mg2+濃度為20 mg/L時高級醇含量最低，為292.37 mg/L，與對照組相比高級醇降低了10.17%，隨著Mg2+濃度的上升，高級醇含量也會增加，這可能是由于適量濃度的Mg2+能激活糖酵解途徑相關酶活性，促進酵母代謝的正常進行，而過量的Mg2+會抑制酵母生長，不利于正常發酵，導致發酵副產物含量升高。

由圖8可知，隨著K+含量的增加，總酸含量呈現緩慢上升的趨勢，高級醇含量呈現先下降后上升的趨勢，而酒精度呈現了先升高再降低的趨勢，這與Mg2+對3種指標的影響相似。當K+添加量在20 mg/L時高級醇含量最低，為297.3 mg/L，與對照組相比高級醇降低了8.66%，可見較低濃度的K+可以維持酵母細胞內外的滲透壓，保證桑椹果酒正常發酵，而過高的K+濃度會導致細胞滲透壓失衡，影響酵母正常的生長繁殖，從而使高級醇含量升高。

圖8 K+添加量對桑椹果酒高級醇含量、酒精度與總酸含量的影響Fig.8 Effect of adding amount of K+ on the content of higher alcohols, alcohol and total acid in mulberry wine

由圖9可知，Ca2+添加量對桑椹果酒酒精度與總酸含量的影響較小，對高級醇含量的影響較為顯著，當Ca2+添加量在40 mg/L時高級醇含量最低，為311.09 mg/L，與對照組相比高級醇降低了4.42%，但與其他2種金屬離子相比，其對桑椹果酒高級醇的降低效果并不明顯。原因可能是Ca2+可以改變高級醇代謝途徑中相關酶活性，使高級醇的生成量降低，但效果不如其他2種金屬離子。

圖9 Ca2+添加量對桑椹果酒高級醇含量、酒精度與總酸含量的影響Fig.9 Effect of adding amount of Ca2+on the content of higher alcohols, alcohol and total acid in mulberry wine

2.2.3 可同化氮源添加量對桑椹果酒高級醇含量的影響

高級醇通過2種途徑合成，其中一種為埃里希[30]途徑，主要是氨基酸在轉氨、脫羧、還原作用下形成相應的高級醇[31]。李智慧等[32]研究表明,可同化氮源對桑椹果酒高級醇含量有重要的影響，故而本次實驗通過添加(NH4)2HPO4、谷氨酸、丙氨酸和精氨酸等可同化氮源，探究其對桑椹果酒高級醇含量的影響。

由圖10～13可知，可同化氮源的添加量對桑椹果酒酒精度的影響不顯著，對總酸含量有影響但總酸含量處于正常水平，本次實驗重點研究高級醇含量，故主要討論可同化氮源對高級醇含量的影響。

圖10 (NH4)2HPO4添加量對桑椹果酒高級醇含量、酒精度與總酸含量的影響Fig.10 Effect of adding amount of diammonium hydrogen phosphate on the content of higher alcohols, alcohol and total acid in mulberry wine

添加谷氨酸對桑椹果酒高級醇含量并無顯著影響(圖11)；添加磷酸二氫銨和丙氨酸對桑椹果酒高級醇含量有顯著性降低，但其添加量之間并無顯著性差異(圖10、圖13)，高級醇含量與對照組相比分別降低了7.46%和6.73%；精氨酸添加量為40 mg/L,對桑椹果酒高級醇含量有顯著性降低，且與對照組相比降低了6.33%。其原因可能是高級醇可以通過氨基酸分解途徑合成，有些特定氨基酸(如天冬氨酸、亮氨酸)可以直接分解成為相應的高級醇，而上述4種可同化氮源不能直接生成高級醇，且在發酵過程中會影響酵母對其他氨基酸的分解作用，從而阻礙高級醇的生成。此結果與李智慧等[30]研究不同種類可同化氮素對黃酒高級醇含量影響的結果一致。

圖11 谷氨酸添加量對桑椹果酒高級醇含量、酒精度與總酸含量的影響Fig.11 Effect of adding amount of glutamic acid on the content of higher alcohols, alcohol and total acid in mulberry wine

圖12 精氨酸添加量對桑椹果酒高級醇含量、酒精度與總酸含量的影響Fig.12 Effect of adding amount of arginine on the content of higher alcohols, alcohol and total acid in mulberry wine

圖13 丙氨酸添加量對桑椹果酒高級醇含量、酒精度與總酸含量的影響Fig.13 Effect of adding amount of alanine on the content of higher alcohols, alcohol and total acid in mulberry wine

2.2 酶制劑、金屬離子和可同化氮源的添加量對桑椹果酒高級醇含量的影響

選取對降低桑椹果酒高級醇效果最好的纖維素酶、KCl、MgCl2及各自最優添加量區間，進行三因素三水平的響應面實驗。響應面實驗結果如表1所示，用Design expert 8.0軟件對響應面結果進行分析，得到回歸模型方差分析見表2。

表1 響應面實驗設計及結果Table 1 Experimental design and results for response surface analysis

表2 回歸模型方差分析Table 2 Analysis of variance of regression model

注： *(P<0.05)表示差異顯著； **(P<0.01)表示差異極顯著

軟件分析結果得到二次多項式回歸方程為：

由圖14可知，纖維素酶和MgCl2對桑椹果酒高級醇的影響并非簡單的線性關系，而是具有交互作用。由Design expert 8.0軟件分析得到有效降低桑椹果酒高級醇的外源添加物最佳配比為纖維素酶0.2 g/L、KCl 20.02 mg/L、MgCl220.17 mg/L，此時桑椹果酒高級醇含量理論值為286.64 mg/L。按此條件進行驗證實驗，得出桑椹果酒高級醇含量為282.34 mg/L，與理論值的相對誤差為1.5%，說明此模型可以較好地模擬和預測外源添加物對桑椹果酒高級醇含量的影響。通過對此次實驗的桑椹果酒進行理化分析和感官品評可知，此桑椹果酒酒精度為12.49±0.36% vol、還原糖為3±0.19 g/L、總酸含量為6.64±0.37 g/L，且顏色為紫紅色、光澤感強、果香適中、酒香馥郁、酒體豐滿、柔和爽口、風味明顯、典型良好，是一款品質優良且高級醇較低的桑椹果酒。

a-纖維素酶和MgCl2交互作用對桑椹果酒高級醇含量影響的響應面圖；b-纖維素酶和MgCl2交互作用對桑椹果酒高級醇含量影響的等高線圖圖14 纖維素酶和MgCl2交互作用對桑椹果酒高級醇含量影響的等高線和響應面圖Fig.14 Contour and response surface of the effect of the interaction between cellulase and MgCl2 on the content of higher alcohols in mulberry wine

3 結論

在桑椹果酒發酵1 d后加入酶制劑能顯著降低桑椹果酒高級醇含量，且酶制劑(糖化酶、果膠酶、纖維素酶)、金屬離子(Mg2+、Ca2+、K+)、可同化氮源(精氨酸、丙氨酸、(NH4)2HPO4)在一定添加量范圍內均能顯著性降低桑椹果酒高級醇含量，谷氨酸對桑椹果酒高級醇的影響不大。對外源添加物的降醇效果進行對比可知，纖維素酶、Mg2+和K+降低桑椹果酒高級醇的效果最佳，對其進行響應面實驗，得到最優復配比為纖維素酶0.2 g/L、KCl 20.02 mg/L、MgCl220.17 mg/L，優化后的桑椹果酒高級醇含量可降低到282.34 mg/L，高級醇的降低率為13.26%。并且對響應面結果分析可知，纖維素酶和MgCl2對桑椹果酒高級醇的影響具有交互作用，兩者配合使用可以顯著降低桑椹果酒高級醇含量。