低溫貯藏期間梨果皮酚類物質及抗氧化性變化

黃怡，高春麗，畢陽，李冬美，董玉鵬，張彥東，李永才

(甘肅農業大學 食品科學與工程學院，甘肅 蘭州，730070)

白梨屬薔薇科梨屬植物，是我國西北地區梨的主栽品種,具有成熟期早、外形美觀、品質優良等特性，且因其皮薄而深受消費者青睞[1]。據國家統計局統計，截止2017年，甘肅省梨產量已經達到2.104×105t，其中蘋果梨、早酥梨和皇冠梨是甘肅省大面積栽培的白梨系統的主要品種[2]。酚類物質普遍存在于植物的根、莖、葉和果實等部位，在果實中的含量比較豐富，但有研究表明與果肉相比，果皮的酚類物質含量更高[3-4]。果蔬中酚類化合物不僅賦予其特殊色澤和風味，而且具有抗菌、清除自由基、抗毒素及抵御生物和非生物脅迫等作用[5]。同時，總酚和類黃酮屬于多酚類物質，具有較強收斂性的多酚往往具有較強的自由基清除能力，相應地也具有較強的藥理活性[6]。因此增加果蔬攝入量可以降低許多不同類型疾病的風險，包括癌癥、心血管疾病、糖尿病和阿爾茨海默癥等[7]。

梨果皮化學組分及生物學功能的系統研究，可為梨果綜合利用及天然、無毒無害的抗氧化資源開發提供依據[8]。白梨果皮中酚類物質含量豐富，有研究表明果皮酚類物質與果實抗氧化能力具有相關性[9]，且其對病原物侵染及潛伏具有調控作用[10]。但酚類化合物由于結構不穩定，在不適宜的光照、pH、氧氣、貯藏溫度等環境條件下，容易發生降解，且酚類物質種類和含量因品種、部位、發育貯藏期和環境條件而異[11]。因此系統研究不同品種梨在低溫貯藏過程中果皮中酚類物質含量及抗氧化能力的變化具有十分重要的意義。盡管目前有關梨果酚類物質含量及其特性的研究報道較多[12-15]，但對甘肅省主栽的3種梨果低溫貯藏期間果皮主要酚類物質變化及其抗氧化特性的研究仍缺乏系統報道。因此本研究以甘肅省的3種白梨蘋果梨、早酥梨和皇冠梨為試材，全面檢測分析3種梨果品種在低溫貯藏期間果皮總酚、總黃酮、8種主要酚類物質含量及變化規律，并測定酚提取物的抗氧化能力及其與各酚類含量的相關性，以期為更好地利用梨果皮的酚類物質及其抗氧化特性提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

供試梨果采自甘肅省景泰縣條山農場，主要包括蘋果梨、早酥梨和皇冠梨3個品種，每品種梨選定3棵樹，每棵樹隨機采摘大小基本一致的10個果，貯藏期均為采后貯藏的前5個月，貯存于0 ℃冷庫中。

酚類標準樣：綠原酸(chlorogenic acid)、咖啡酸(caffeic acid)、對香豆酸(p-coumanic acid)、阿魏酸(ferulic acid)、兒茶素((+)-catechin)、表兒茶素((+)-epicatechin)、蘆丁(rutin hydrate)、熊果苷(arbutin)以及其他試劑，均購自sigma公司。

1.2 儀器與設備

Agilent 1100高效液相色譜儀，美國安捷倫公司；UV-2450日本島津紫外可見分光光度計，上海旦鼎國際貿易有限公司；Eclipsc Plus C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，美國安捷倫公司；AWL-1002-M艾科普超純水儀，重慶頤洋企業發展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 梨果皮酚類物質的提取

參考李磊等[16]旳方法。取梨果皮40 g，加入30 mL 70%(體積分數)丙酮勻漿后，超聲波提取25 min后抽濾，40 ℃下用氮吹干儀去除丙酮。水相用1 mol/L的NaOH和HCl調pH，加20 mL乙酸乙酯萃取，分離出酯相后合并，在30 ℃下用氮吹干儀去除乙酸乙酯，用甲醇(色譜純)定容到3 mL，0.45 μm有機濾膜過濾后備用。

1.3.2 總酚與總黃酮測定

總酚含量測定參考SINGLETON等[17-18]的方法。取0.125 mL酚提取液并加入0.5 mL蒸溜水和0.125 mL福林肖卡試劑，旋渦混合后靜置反應6 min，加入1.25 mL 7% Na2CO3溶液和1 mL蒸餾水，室溫避光靜置反應90 min后在760 nm波長下測其吸光度，同時以0.125 mL甲醇代替提取液作為空白對照。用不同濃度梯度的沒食子酸標準品溶液，測定吸光度并繪制標準曲線。總酚含量以每千克鮮樣所含的沒食子酸當量(GAE)表示，單位為g GAE/kg。

總黃酮含量測定參考JIA等[18-19]的方法。取0.3 mL酚提取液，加入1.5 mL蒸溜水和0.09 mL 5% NaNO2溶液，旋渦混合后靜置反應5 min，加入0.18 mL 10% AlCl3·6H2O混合后靜置6 min，之后再加入0.6 mL 1 mol/L NaOH溶液和0.33 mL蒸餾水，在510 nm處測吸光度，同時以0.3 mL甲醇代替提取液作為空白對照。用不同濃度梯度的兒茶素標準品溶液，測定吸光度并繪制標準曲線。總黃酮含量計算以每千克鮮樣所含的兒茶素當量(CE)表示，單位g CE/kg。

1.3.3 HPLC測定8種酚類物質含量

通過全波長紫外掃描到流動相以及所測各單酚在紫外光區的最大吸收波長。HPLC測定條件如下：酚酸類測定波長為323 nm，黃酮類測定波長為297 nm，蘆丁為358 nm。以乙腈和1%(體積分數)乙酸為流動相。將8種單酚分別配成甲醇溶液，并在已確定的色譜條件下測定，確定標準物質的保留時間，用保留時間結合增高法定性，根據色譜中峰面積與樣品中標準物質的含量關系進行線性回歸，通過計算相關系數，得出樣品中的酚類物質的含量。

1.3.4 抗氧化能力測定

DPPH自由基清除能力的測定參考LOCATELLI等[20]方法。取0.2 mL稀釋后的酚提取液加入2.8 mL 70 mmol/L的DPPH甲醇溶液，混勻后室溫環境避光反應30 min后，于515.5 nm波長下測吸光度。ABTS+·清除能力測定參考RE等[21]的方法。將配制的7 mmol/L的ABTS+·水溶液和2.45 mmol/L的過硫酸鉀水溶液混合定容至25 mL后，室溫避光條件下靜置反應12 h，之后稀釋混合液至其在734 nm波長下的吸光度為0.700±0.020。取0.15 mL稀釋后的酚提取液，加入3 mL ABTS+·溶液反應30 min，于734 nm波長下測其吸光度。FRAP抗氧化能力的測定參考BENZIE等[22]的方法。取0.2 mL酚提取液，加入2.8 mL的FARP溶液，室溫下避光靜置反應30 min，在593 nm下測其吸光度。以甲醇代替提取液作為空白對照，以Trolox為標樣做標準曲線，抗氧化能力以每千克鮮樣所含的Trolox當量(TE)表示，單位為mg TE/kg。

1.4 數據統計

每個試驗重復3次，本實驗采用Microsoft Excel 2007和SPSS 19.0統計分析軟件進行統計處理并作圖。

2 結果與分析

2.1 貯藏期梨果皮總酚、總黃酮含量

貯藏過程中3種梨果皮總酚含量總體呈降低的趨勢，且品種之間差異并不顯著(圖1-A)。梨果皮總酚含量變化范圍為0.346 ～ 0.646 g GAE/kg，其中在貯藏前期總酚含量相對較高，且在貯藏第一個月迅速下降，在貯藏30 d時蘋果梨、早酥梨、皇冠梨果皮總酚含量較貯藏初期分別下降了37.9%、37.1%和35.9%(圖1-A)。

由圖1-B可見，與總酚類似，3種梨果皮總黃酮含量均隨貯藏期延長而降低，但不同品種之間存在差異，其中早酥梨果皮中總黃酮含量較高，平均含量分別為蘋果梨和皇冠梨的1.32和1.20倍。同樣其含量在貯藏前期下降較快，其中蘋果梨在貯藏60 d時果皮總黃酮含量降至0.362 g CE/kg，僅為貯藏初期的32.7%(圖1-B)。

圖1 低溫貯藏期間3種梨果皮總酚(A)和總黃酮(B)含量變化Fig.1 Changes in total phenolic content (A) and total flavonoids content (B) of three kinds of pear peel during cold storage注：豎線表示標準誤(±SE)，下同。

2.2 貯藏期梨果皮主要酚類物質含量的比較

2.2.1 梨果皮酚酸類物質含量的變化

貯藏期間3種梨果皮綠原酸和咖啡酸含量的變化規律存在一定差異(圖2-A，圖2-B)。梨果皮綠原酸的含量依次為蘋果梨>皇冠梨>早酥梨，其中在貯藏前期綠原酸的含量相對較高，蘋果梨在貯藏第60天時果皮的綠原酸含量為初期的1.35倍(圖2-A)。由圖2-B可知，早酥梨和皇冠梨在貯藏前期果皮咖啡酸含量均呈先上升的趨勢，其中早酥梨果皮在貯藏第30天含量達到最高，含量是初期的1.48倍，而皇冠梨的含量則在第60天達到峰值，蘋果梨的咖啡酸含量在整個貯藏期間變化不大(圖2-B)。

3種梨果皮對香豆酸和阿魏酸含量在梨果貯藏期間的變化存在較大差異，除早酥梨果皮對香豆酸和阿魏酸含量在貯藏末期略有升高外，早酥梨和皇冠梨果皮的對香豆酸和阿魏酸含量在貯藏期均維持在較低水平且呈緩慢降低趨勢，而蘋果梨果皮阿魏酸含量在整個貯藏過程持續降低，對香豆酸含量在貯藏前期呈上升趨勢，后期迅速下降，在第60天時含量達到初期的3.82倍(圖2-C，圖2-D)。

圖2 低溫貯藏期3種梨果皮綠原酸(A)、咖啡酸(B)、對香豆酸(C)和阿魏酸(D)含量變化Fig.2 Changes in chlorogenic acid (A), caffeic acid (B), p-coumanic acid (C) and ferulic acid (D) contents of three kinds of pear peel during cold storage

2.2.2 梨果皮黃酮類物質含量的變化

3種梨果在貯藏過程中，除早酥梨果皮的兒茶素含量持續上升外，果皮兒茶素和表兒茶素總體上呈先上升后下降的趨勢，其中蘋果梨果皮的表兒茶素含量顯著高于其他兩個品種，其平均含量分別是早酥梨和皇冠梨的1.42和1.94倍(圖3-A，圖3-B)。蘋果梨和皇冠梨果皮的蘆丁含量在貯藏前期變化趨勢不明顯，但在貯藏最后1個月顯著升高，在貯藏120 d達到了整個貯藏期的最高值，分別是貯藏初期的1.45和2.08倍，早酥梨果皮的含量在第30天達到峰值，之后變化趨勢不明顯(圖3-C)。

圖3 低溫貯藏期3種梨果皮兒茶素(A)、表兒茶素(B)、蘆丁(C)含量變化Fig.3 Changes in (+) -catechin (A), (+) -epicatehin (B) and rutin hydrate (C) contents of three kinds of pear peel during cold storage

2.2.3 梨果皮熊果苷含量的變化

貯藏期3種梨果熊果苷含量總體呈先上升后下降的趨勢，早酥梨和皇冠梨果皮的熊果苷含量是略高于蘋果梨的，其中蘋果梨和皇冠梨在貯藏第1個月迅速升高，在貯藏第30天含量較初期分別增加了20.1和23.6 mg/g FW，而早酥梨在第60天含量達到最高值(圖4)。

圖4 低溫貯藏期3種梨果皮類熊果苷物質含量變化Fig.4 Changes in arbutin content during cold storage of three kinds of pear peel

2.3 梨果皮的抗氧化特性及其與果皮酚類物質的相關性

2.3.1 貯藏期梨果皮抗氧化特性變化分析

2.3.1.1 DPPH自由基清除能力

3種梨果皮在貯藏期DPPH自由基清除能力均呈下降趨勢，清除速率變化范圍約在43.70～64.35 mg TE/kg，以皇冠梨的DPPH自由基清除能力相對較高。其中在貯藏前期清除速率相對較高，且在貯藏第1個月迅速下降，在貯藏第30天時蘋果梨、早酥梨和皇冠梨DPPH自由基清除能力較貯藏初期分別下降了26.4%、28.5%和24.5%(圖5)。

圖5 低溫貯藏期梨果皮DPPH自由基清除能力的測定Fig.5 Changes in the capacity of DPPH radical scavenging during cold storage of three kinds of pear peel

2.3.1.2 ABTS+·清除能力

與DPPH自由基清除能力基本一致，3種梨果皮ABTS+·清除能力均隨貯藏期延長而降低，且三者之間差異不顯著。其中以蘋果梨的ABTS+·清除能力相對較高，同樣其清除能力在貯藏前期下降較快，在貯藏第30天時蘋果梨、早酥梨和皇冠梨ABTS+·清除能力較貯藏初期分別下降了21.4%、25.0%和25.2%(圖6)。

圖6 低溫貯藏期梨果皮ABTS+·清除能力的測定Fig.6 Changes in the capacity of ABTS+· radical scavenging during cold storage of three kinds of pear peel

2.3.1.3 FRAP抗氧化能力

貯藏期3種梨果皮的FRAP抗氧化能力均呈下降趨勢，其中蘋果梨、早酥梨和皇冠梨果皮的平均FRAP抗氧化能力分別為184.50、192.51和160.62 mg TE/kg，同樣其抗氧化能力均在第一個月降幅較大，在貯藏末期時蘋果梨、早酥梨和皇冠梨的FRAP抗氧化能力較初期分別降低了40.8%、39.1%和61.2%(圖7)。

圖7 低溫貯藏期梨果皮FRAP抗氧化能力的測定Fig.7 Changes in the value of FRAP during cold storage of three kinds of pear peel

2.3.2 抗氧化能力與酚類物質含量的相關性分析

由表1可知，3種梨果皮抗氧化能力均與酚類物質存在一定的相關關系，其中DPPH、ABTS+·清除速率、FRAP均與總酚含量呈極顯著正相關(P<0.01)，蘋果梨抗氧化能力也與總黃酮含量極顯著正相關(P<0.01)，與蘆丁含量顯著正相關(P<0.05)。而皇冠梨抗氧化能力與阿魏酸含量極顯著正相關(P<0.01)，FRAP抗氧化能力與總黃酮含量極顯著正相關(P<0.01)，早酥梨DPPH自由基清除能力與總黃酮含量顯著正相關(P<0.05)，表明總酚、總黃酮、阿魏酸、蘆丁是梨果皮抗氧化性的主要貢獻者(表1)。

表1 低溫貯藏期酚類物質含量與抗氧化活性的相關性Table 1 Relationship between the phenolic contents and antioxidant capacity during cold storage

注：**表示為0.01的極顯著水平；*表示為0.05的顯著水平。

3 討論

果實中的酚類物質含量會隨貯藏期的延長而變化，且其變化規律因果實品種和貯藏環境而異[23-24]。本實驗對8種主要酚類物質含量測定結果表明，3種梨果皮酚類物質中熊果苷含量均呈現最高，綠原酸次之，蘋果梨、早酥梨和皇冠梨在貯藏期間果皮的熊果苷平均含量分別達到10.22、16.92和11.17 mg/g FW(圖4)，這與張小雙等[25]的報道基本一致，他們發現在早酥梨和南果梨中，除果肉和果心外，其他部位含量最高的多酚均為熊果苷。3種梨果在低溫貯藏期間果皮總酚均呈下降趨勢(圖1-A)，該結果與畢陽等[26]對蘋果梨、鴨梨和冬果梨中的研究一致，這可能是低溫條件下，果實的生化反應程度減弱導致的。LI等[27]研究也發現黃冠梨的總酚含量在0和10 ℃冷藏10 d之后，呈下降趨勢，而10 ℃貯藏的果實中總酚含量在第一個月保持較高的水平。在低溫貯藏過程中早酥梨果皮的兒茶素和蘋果梨、皇冠梨中的蘆丁含量在貯藏期間呈升高趨勢，其他主要酚類物質含量均隨貯藏時間延長而下降(圖2～圖4)，這一現象應該是梨果貯藏過程中果皮酚類物質之間的相互轉化的結果。同時發現3個品種白梨皮中酚酸類物質綠原酸、咖啡酸、對香豆酸和阿魏酸含量在低溫貯藏期間變化規律不同，這可能是由于不同品種梨果后熟過程中對果皮酚類物質代謝的調控機制存在差異或不同品種梨果響應低溫進而介導果皮酚類物質轉化的途徑不同，但具體機理尚需進一步研究揭示(圖2)。目前也有研究表明采后處理會影響梨果冷藏過程中酚類物質的變化[28]。KOU等[29]發現2% CaCl2浸泡和1%普魯蘭多糖涂層能有效延緩0 ℃冷藏的皇冠梨酚類化合物質的損失。也有研究報道外源二氫茉莉酸丙脂(PDJ)處理可以有效提升南果梨酚類代謝水平，對果皮中黃酮醇含量及果肉中黃烷醇、熊果苷含量有顯著促進作用，從而提高果實的保健功能性[30]。

酚類物質具有較強的自由基清除能力[31-32]。大量研究表明，植物的抗氧化能力在很大程度上取決于其酚類物質的種類和含量[33-35]。為了更全面揭示酚類物質的抗氧化效果，可采用多種方法來評價樣品的抗氧化能力[36]。KOLNIAK-OSTEK[14]使用DPPH和FRAP方法測定梨果皮的潛在抗氧化能力，“Radana”和“Bonkreta”表現出較高的活性化合物濃度和抗氧化能力，“Uta”品種的抗氧化能力最低。同樣有研究評估了10個梨品種間抗氧化能力的差異性，在FRAP測定方法中，金秋梨果皮提取物抗氧化能力最強，而在DPPH方法中，鴨廣梨、紅啤梨和青啤梨的提取物抗氧化能力最高[37]，表明不同的測定方法評價樣品的抗氧化能力得到的結果存在差異性。本研究采用了ABTS+·、DPPH和FRAP 3種方法系統評價了梨果皮酚類提取物對自由基的清除能力，發現3種梨果皮均具有一定的抗氧化能力，但其抗氧化能力均在第一個月迅速下降(圖5～圖7)，可見3種梨果皮均可作為天然抗氧化物質的主要來源，且鮮食能夠更好地利用其抗氧化特性。已有大量研究表明，果蔬的抗氧化能力受總酚和總黃酮含量的影響較大，特別是總酚含量與其抗氧化能力具有非常顯著的相關關系[27,38-39]。與本研究相關性分析結果類似，在低溫貯藏期間3種梨果皮抗氧化能力均與總酚呈極顯著相關，部分抗氧化指標與總黃酮、阿魏酸和蘆丁含量也呈顯著正相關性(表1)。而梨果皮酚類物質含量測定結果表明，熊果苷和綠原酸的含量較高，但這兩種物質均與抗氧化能力沒有明顯的正相關，說明這兩種物質對于梨果抗氧化能力沒有明顯的貢獻，而是影響梨果的其他品質特性。

4 結論

低溫貯藏期間3種梨果皮總酚和總黃酮均呈降低趨勢，且在貯藏第一個月迅速下降，其中早酥梨果皮總黃酮含量在貯藏期保持在較高水平。貯藏期間8種主要酚類物質含量存在較大差異，除了早酥梨中兒茶素和蘋果梨、皇冠梨中蘆丁含量在貯藏期間呈升高趨勢外，其他主要酚類物質含量均隨貯藏時間延長而下降。3種梨果皮均表現出較高的抗氧化能力，但不同的抗氧化評價方法得到的結果存在一定差異，且抗氧化能力均在第一個月迅速下降；相關性分析表明，3種梨果皮抗氧化活性與總酚、總黃酮和阿魏酸含量存在顯著正相關關系(P<0.05)。可見，梨果皮酚類物質含量因品種、貯藏條件和時間而不同，因此系統掌握了梨果皮酚類物質的變化規律及調控機制，可為梨果皮功能成分開發及綜合利用提供理論依據。