采后乙烯脫綠處理“尤力克”檸檬

劉路，劉孝平，黃磊，王愛華，孫恒嵩，付云云，陳安均

(四川農業大學，四川 雅安，625014)

檸檬(Citruslimon(L.) Burm. F.)為蕓香科柑橘屬常綠小喬木，在世界柑橘業中排在第3位[1]。尤力克檸檬是檸檬種子的實生變異，原產于美國，是世界上培育面積最廣、產量最多的品種[2]。果實套袋是一種物理保護方法，在果實生產發育過程中，阻隔了果面與外界的接觸[3]，可以保護果實不受病蟲危害，使果面著色均勻[4]，套袋技術已在梨[5]、獼猴桃[6]等水果栽培中得到了廣泛的應用，但是套袋處理可以抑制抗壞血酸的積累以及抑制一些糖和有機酸的合成[7]。檸檬主要以鮮果銷售為主，大部分在充分成熟以前、含酸量最高時采收，此時果皮呈綠色，商品品質欠佳。適當早采收的檸檬雖固酸比已達到成熟水平且口感宜人，但果皮卻為綠色，尤其南方地區果實成熟季節高溫多濕(特別是夜間高溫)，常干擾柑桔果皮特有色澤的呈現，果面呈黃綠相間的斑駁狀。因此，檸檬的脫綠處理便成了一種迎合顧客消費觀的手段[8]。檸檬脫綠是利用激素的刺激，促進轉化酶的活動,促使果皮中葉綠素降解和類胡蘿卜素顯現的過程，從而縮短果皮由綠變黃的時間。

套袋已被廣泛應用于水果作物以改善水果品質，套袋處理可使血橙的總花青素濃度增加，而總可溶性固形物、總酚、抗壞血酸濃度和可滴定酸度隨著套袋處理而降低[9]。乙烯及脫落酸等激素脫綠在柑橘采后也有報道，乙烯利脫綠后，可溶性固形物、總酸、抗壞血酸含量略有波動，但尚未發現不良影響[7]。但是乙烯利處理的柑橘果實脫綠時間長，蜜柑乙烯利脫綠時間長達9 d[10],因此本實驗采用乙烯脫綠處理，縮短脫綠時間的同時可以有效改善檸檬的果皮色澤。

本文研究了乙烯脫綠處理對尤力克檸檬果皮顏色以及內部品質的影響，發現乙烯脫綠處理可以有效改善尤力克檸檬的果皮顏色，且對尤力克檸檬果實的內在品質尚無不良影響，該研究可為乙烯脫綠處理在檸檬上的應用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

“尤力克”檸檬于2018年11月2日采自四川省安岳縣姚市檸檬果園，在果園的不同方位選取果樹，并在果樹的不同方位摘取套袋及非套袋(青)檸檬，大小均一、無機械損傷、成熟度適中(TSS>8，質量為140～180 g)的夏花果，果袋購自四川眉山市冠榮制袋有限公司。

乙烯：95%純度，南京上元工業氣體廠；2,4-二氯苯氧乙酸、CuSO4、K2SO4、H2SO4、硼酸、甲基紅指示劑、溴甲酚綠指示劑、亞甲基藍指示劑、NaOH、乙醇、福林酚試劑、Na2CO3、NaNO2、Al(NO3)3、蘆丁、沒食子酸、三氯乙酸、乙二胺四乙酸二鈉、硫代巴比妥酸、丙酮、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚、草酸、抗壞血酸、2,6-二氯靛酚：分析純，成都科龍化工試劑廠；2,4-D試劑盒，深圳容金科技有限公司。

1.1.2 主要儀器設備

TA.XTPlus物性分析儀，英國StabieMicro System公司；Varioskan Flash酶標儀,美國Thermo公司；Ulupure超純水儀，成都優普；X3R高速冷凍離心機，美國安捷倫公司；HP-C226色差儀，上海譜熙光電科技有限公司；S-433D全自動氨基酸分析儀，德國賽卡姆公司；CX21生物顯微鏡,日本奧林巴斯公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗材料預處理

將采摘下來的檸檬用質量濃度20 g/L的次氯酸鈉溶液浸泡1～2 min，消毒殺菌，清洗干凈后置于20 ℃下自然風干，將果實分組，套袋檸檬為一組，青檸檬分為2組，分別為對照組與采后乙烯脫綠組。采后乙烯脫綠組是將檸檬用質量濃度30 mg/L的2,4-D浸泡2 min，風干后移入脫綠室中，脫綠室條件為：乙烯質量濃度為5 mg/L，溫度為28 ℃，濕度為95%，CO2濃度小于0.3%，處理時間為5 d，采用2,4-D試劑盒測定其2,4-D殘留量，其殘留量低于國標的1 mg/kg。

1.2.2 指標測定

色差的測定：采用精密色差儀測定檸檬赤道周圍4個點。

外觀的觀察拍照以及果皮的組織觀察：拍照采用尼康D7100相機，果皮組織觀察用生物顯微鏡進行觀察。

抗壞血酸的測定：根據GB 5009.86—2016[11]測定。

總酸的測定：根據GB/T 12456—2008[12]測定。

可溶性固形物含量的測定：使用阿貝折光儀進行測定。

硬度的測定：用TA.XTPLus物性分析儀測定檸檬赤道周圍4個點的硬度，選用P5探頭，測試前、中、后速度分別為1、5、5 mm/s，位移為20 mm，時間為5 s，觸發力10 g，高度校正的返回距離為70 mm，速度10 mm/s，TPA結果采用儀器自帶宏程序TPA-macro分析。

葉綠素、類胡蘿卜素的測定：根據文獻[13]修改如下，稱取1 g果皮置于研缽中，加入液氮、石英砂及含0.1‰BHT(2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚)的丙酮溶液研磨成勻漿，經過多次研磨使組織發白，于4 000g離心10 min，取上清液定容至25 mL，用酶標儀分別測470、645、662 nm處的吸光值。按照公式(1)(2)(3)分別計算葉綠素a、葉綠素b，類胡蘿卜素含量。

Ca=11.75A662-2.35A645

(1)

Cb=18.61A645-3.96A662

(2)

(3)

式中：Ca，葉綠素a含量;Cb，葉綠素b含量;Cxc，類胡蘿卜素含量;A662，662 nm處的吸光值;A645，645 nm處的吸光值;A470，470 nm處的吸光值。

蛋白質的測定：根據GB 5009.5—2016[14]測定。

氨基酸的測定：根據GB 5009.124—2016[15]測定。

總酚、黃酮的測定：根據文獻[16-17]修改如下，總酚采用Folin-Ciocalteus法，取樣品1 g，加入80%的甲醇研磨，離心后定容至10 mL，作為提取液，取提取液0.8 mL加入4 mL稀釋10倍的Folin-Ciocalteus試劑混合均勻，5 min后加入100 g/L的Na2CO3溶液6 mL，常溫放置1 h，果皮稀釋2倍，果肉不稀釋，于765 nm處測定吸光值，以體積分數80%甲醇為對照，以沒食子酸為標曲，樣品中總酚含量以每千克鮮重含毫克沒食子酸當量表示(mg GA/g FW)。黃酮的測定：取提取液0.5 mL，加入4.5 mL體積分數30%乙醇，再加0.4 mL 50 g/L NaNO2搖勻，5 min后，加0.4 mL 100 g/L Al(NO3)3搖勻，6 min后，加0.4 mL, 1 mol/L NaOH，用體積分數30%乙醇定容至10 mL，放置15 min，測定510 nm處吸光值。

丙二醛的測定：根據文獻[18]修改如下：稱取樣品5 g。置于具塞錐形瓶中，準確加入50 mL三氯乙酸溶液，搖勻，加塞密封，置于恒溫振蕩器中振蕩30 min，冷卻、過濾備用。取5 mL濾液，5 mL三氯乙酸混合液為樣品空白，分別加入5 mL硫代巴比妥酸水溶液，水浴10 min，取出冷卻至室溫，測定450、532、600 nm處測定吸光值。根據公式(4)計算丙二醛含量。

C(μmol/L)=6.45(A532-A600)-0.56A450

(4)

式中：A532，532 nm處的吸光值；A600，600 nm處的吸光值；A450，450 nm處的吸光值。

1.2.3 數據分析

使用Origin 8.1、SPSS等軟件處理實驗數據，P<0.05表示顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 脫綠處理對尤力克檸檬外在指標的影響

如圖1、圖2所示，脫綠組檸檬的硬度顯著低于套袋組和對照組，這可能是脫綠過程中乙烯作用所導致的結果。套袋組檸檬的亮度顯著高于脫綠組和對照組，對照組檸檬的紅綠色度顯著低于套袋組和脫綠組，呈現出負值，這是由于對照組的檸檬為綠色。對照組檸檬的葉綠素a，顯著高于套袋組和脫綠組；對照組檸檬的葉綠素b顯著高于套袋組和脫綠組，對照組類胡蘿卜素含量顯著低于套袋組，套袋組顯著低于脫綠組，說明在采后脫綠過程中，大部分葉綠素a和葉綠素b已降解，類胡蘿卜素大量合成，導致檸檬果皮顏色發生變化，表現為紅綠色度的提高。通過顯微鏡觀察可以發現，對照組果皮組織結構中有很多葉綠體，在脫綠組和套袋組中并沒有發現葉綠體，說明葉綠素的降解與葉綠體的消失有關。

圖1 脫綠處理對尤力克檸檬外在指標的影響Fig.1 Effect of de-greening treatment on the external indicators of Eureka lemon注：不同字母表示顯著性差異(P<0.05)。下同。

圖2 脫綠處理對尤力克檸檬內在品質的影響Fig.2 Effect of de-greening treatment on the internal index of Eureka lemon

2.2 脫綠處理對尤力克檸檬內在品質的影響

糖酸是柑橘類果實的主要營養物質，柑橘類果實缺乏儲備型碳水化合物，而是以可溶性糖的積累為主，它的可溶性糖主要來源于葉片的光合作用產物[19]，3組檸檬的可溶性固形物含量無顯著性差異。脫綠組與對照組的抗壞血酸含量和總酸含量均高于套袋組。說明脫綠組在內在品質方面優于套袋組。

2.3 脫綠處理對尤力克檸檬蛋白質、氨基酸、活性物質以及丙二醛含量的影響

脫綠處理對尤力克檸檬蛋白質的影響如圖3所示，脫綠處理對尤力克檸檬的果皮與果肉中的蛋白質含量無顯著性影響，尤力克檸檬的果皮中蛋白質含量約為果肉中蛋白質含量的2倍。

圖3 脫綠處理對尤力克檸檬不同部位蛋白質含量的影響Fig.3 Effect of de-greening treatment on protein content in different parts of Eureka lemon注：相同字母表示無顯著性差異(P<0.05)。

氨基酸是重要的營養成分之一，不同的含量和組分直接影響其營養價值及保健價值[20]。尤力克檸檬果肉中的氨基酸種類較齊全，本實驗測定的17種氨基酸在脫綠組、套袋組以及對照組檸檬果肉中均可檢出(表1)，但是在含量上略有差異，對照組和脫綠組檸檬中氨基酸的總量無顯著性差異，但是對照組與脫綠組氨基酸總量均顯著大于套袋組，這可能與套袋組在生長過程中的光照少于對照組與脫綠組有關。在對照組和脫綠組的果皮中未檢測到蘇氨酸、甲硫氨酸和異亮氨酸，但是脫綠組檸檬果皮中氨基酸總量顯著高于套袋組和對照組。果皮中的氨基酸總量顯著高于果肉中的氨基酸總量，因為氨基酸是組成蛋白質的最小單位，因此這與果皮中蛋白質含量顯著高于果肉中的蛋白質含量相呼應總酚和黃酮均具有抗氧化活性，可以預防一些慢性病的發生。脫綠處理對尤力克檸檬活性物質的影響如圖4，黃酮與總酚在果皮中的含量均顯著高于果肉中含量，這與高煒等[21]研究的結果相符合。脫綠組果皮中的總酚顯著高于對照組果皮中的總酚含量，黃酮在果皮中含量為：脫綠組>對照組>套袋組，說明脫綠處理可以顯著提高總酚和黃酮等活性物質的含量。

表1 脫綠處理對尤力克檸檬氨基酸含量的影響 單位：mg/100 g

注：ND表示未檢出。

丙二醛含量代表植物的衰老程度，丙二醛含量越高，說明植物的衰老程度越高，脫綠組檸檬果皮與果肉中的丙二醛含量在套袋組和對照組之間，對照組果皮與果肉中的丙二醛含量均為最低，可以得出對照組的衰老程度較套袋組和脫綠組低(圖5)。

3 討論

采后脫綠處理對尤力克檸檬的可溶性固形物含量、總酸、抗壞血酸等內在品質無顯著性影響，且總酸及抗壞血酸的含量顯著高于套袋處理的檸檬，這與ZHANG P等[7]的研究結果一致。

圖4 脫綠處理對尤力克檸檬活性物質的影響Fig.4 Effect of de-greening treatment on active subst-ances of Euclid lemon

圖5 脫綠處理對尤力克檸檬丙二醛含量的影響Fig.5 Effect of de-greening treatment on the content of malondialdehyde in eucalyptus

從外在指標看，脫綠處理可以顯著降低果皮中葉綠素的含量并且促進類胡蘿卜素的合成，從而提高了a*值，本實驗結果與袁梓洢等[22]的研究結果一致，但是脫綠處理顯著降低了尤力克檸檬果實的硬度，可能是乙烯脫綠處理加速了檸檬果實的衰老，該結果也與丙二醛含量顯著增加相呼應。

氨基酸是構成生物體大分子蛋白質的基本單位，對機體的生命活動起著重要的作用，17種氨基酸均在尤力克檸檬果肉中被檢出，可見尤力克檸檬具有重要的營養及保健價值。脫綠處理不會造成蛋白質的降解，未經套袋處理的檸檬果皮中未檢出甲硫氨酸、異亮氨酸，可能這2種氨基酸的合成與光照存在一定的關系。脫綠處理顯著提高了尤力克檸檬果皮中黃酮和總酚的含量，曲文穎等[23]的研究表明，一定濃度的乙烯利可以促進黃酮和總酚在藍莓中的積累，與本實驗結果相符，也有研究表明[7]，乙烯利處理檸檬可以增加其抗氧化能力，這可能與總酚和黃酮的積累有關。

4 結論

乙烯脫綠處理后有效改善了檸檬的外部顏色，促進了葉綠素的分解，以及類胡蘿卜素的合成。除此之外，還發現乙烯脫綠組的黃酮與總酚含量顯著高于套袋組與對照組。套袋處理增加了果實的生產成本，且造成了一定的資源浪費以及環境污染問題，不僅如此，套袋處理還會抑制抗壞血酸的積累以及抑制一些糖和有機酸的合成。采后脫綠處理可以減少生產過程中的套袋環節，并且可以達到或者大于套袋處理的檸檬果實的品質。該研究表明，采后乙烯脫綠處理是一種有效且經濟的方法，可以改善檸檬果皮顏色以及檸檬果實品質。