不同培養基對牡丹、芍藥雜交種胚培養的研究

賀丹,蘇曉迪,何松林,解夢珺,鄭云冰,王政,劉藝平

不同培養基對牡丹、芍藥雜交種胚培養的研究

賀丹1,2,蘇曉迪1,何松林1,2*,解夢珺1,鄭云冰1,王政1,劉藝平1

1. 河南農業大學林學院, 河南 鄭州 450002 2. 河南科技學院, 河南 新鄉 453003

目前牡丹、芍藥遠緣雜交種胚的挽救未能建立起高效穩定的體系，雜交種胚珠和幼胚培養的研究也鮮少報道。本文通過對牡丹、芍藥雜交敗育前的雜交胚進行培養，研究了不同培養基對雜種胚萌發的影響。以牡丹品種‘鳳丹白’（‘Feng dan bai’）、芍藥品種‘粉玉奴’（‘Fen yu nu’）為親本，進行遠緣雜交。本研究以MS為基本培養基，添加不同濃度的激素組合，對雜交種胚正常生長的初代培養基進行了篩選，認為處理為MS + 6-BA 1.0 mg·L-1+ NAA 0.1 mg·L-1+ 3%蔗糖的膨大率，發芽率及發芽勢相對較高，是較好的初代培養基。將初代培養基上的幼苗轉移至繼代培養基上，30 d后發現，各項指標最優的處理為MS + IBA 0.2 mg·L-1+ GA30.2 mg·L-1+ 6-BA 0.2 mg·L-1+ 3%蔗糖，其次為MS + IBA 0.1 mg·L-1+ GA30.3 mg·L-1+ 6-BA 0.2 mg·L-1+ 3%蔗糖。本試驗在生根培養30 d后發現，MS + IBA 0.3 mg·L-1+ NAA 0.2 mg·L-1+ 3%蔗糖的培養效果較好，根狀突起較多，根數及根長都相對較高。胚培養結果表明：培養基種類不同，對胚的誘導分化也有所不同。

牡丹; 芍藥; 雜交種; 培養基; 胚培養

牡丹（）是溫帶原產落葉灌木，因其花大色艷、華貴芬芳，長期以來深受人們的喜愛，是我國著名的觀賞、藥用植物[1]。芍藥（）為芍藥科芍藥屬植物，芍藥作為花卉資源，因花大色艷、品種繁多，經過人工的配置即可形成引人入勝的景觀，具有極高的園林觀賞的價值[2,3]。然而在現實生產過程中牡丹芍藥的繁殖會遇到多種困難[4]。作為植物繁殖的新手段，組織培養技術已廣泛普及，其優點是它在短時間和較少的空間內，從一個小個體產生大量的植株，因其繁殖系數高且周期短，大大加快了育種進程[5-7]。目前，牡丹、芍藥遠緣雜交種胚的挽救還未能建立起高效穩定的體系，而且雜交種胚珠和幼胚培養的研究也鮮少報道。因此，在以后的工作中，應著重從繼代培養基的篩選、激素組合、減輕褐化等方面進行雜種胚挽救的研究，為今后牡丹的育種工作開辟新的方向。有研究表明幼胚培養能夠使胚快速萌發成苗，將萌發時間提前，可用于挽救雜種胚敗育、解除種子休眠、將育種周期提前、提高發芽率等，加速育種的進程[8,9]。而雜交育種是提高植物觀賞價值、選育植物新品種的重要途徑[10]。然而園藝植物種間和屬間雜交經常會碰到一些阻滯，如花粉無法正常萌發、花粉管畸形生長，或受精后胚與胚乳畸形生長、種胚敗育、無法順利萌發等[11]。為了滿足市場生產需求，胚挽救技術在雜交育種工作中被廣泛應用，不僅可以克服部分障礙，加快植物育種進程，也成為了研究者們在植物種質創新和新品種培育方面爭相發掘的課題[12,13]。同時，該技術在快速繁殖方面也有巨大潛力。在胚挽救過程中，為了降低對胚的傷害，保證培養中胚的順利生長，盡量直接用胚珠或子房進行培養，其中胚珠與胚培養是較為常用的方式。如今，胚培養技術已經在一些農作物（小麥等）及園藝植物（橄欖、七葉樹等）上獲得了一定進展[14-16]，已有研究發現，胚的不同發育時期及培養基等對胚培養的結果具有非常大的影響，胚培養開始逐漸由培養成熟胚向近成熟胚培養發展[17-19]。但在雜交胚育種工作中仍有諸多問題尚未解決，如幼胚繼代培養、雜交種褐化嚴重問題都大大影響了育種工作的效率[20]。

本試驗以前人的技術和研究理論為基礎[21,22]，選擇花期相近、生長勢較強的牡丹芍藥品種為父母本，開展遠緣雜交試驗，研究培養基、激素組合對雜交種幼胚誘導的影響，由此選擇出牡丹芍藥胚挽救的最適培養基類型及激素配比組合，旨在獲得遠緣雜交育種材料的同時，探討出適合雜種胚培養的最佳培養基，為今后牡丹芍藥的遠緣雜交育種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗地點與材料

實驗地點在河南農業大學苗木基地進行試驗。選用生長勢強，枝繁葉茂，枝干健壯的牡丹和芍藥作為供試材料，根據試驗條件對雜交后的種胚進行選取。材料種類：牡丹‘鳳丹白’（‘Feng dan bai’）；芍藥‘粉玉奴’（‘Fen yu nu’）。

1.2 雜交試驗方法

選擇生長勢強、花藥繁密的‘粉玉奴’（父本），與結實力強的‘鳳丹白’（母本）進行雜交，于松蕾期，去掉雄蕊和花瓣，套袋并掛上標簽，每天觀察柱頭的時期及形態特征，直至第10 d。為保證授粉成功，連續授粉3 d。授粉后立即套袋，掛上標簽，并注明授粉日期，以最后一次授粉時間作為授粉受精過程的開始，于授粉后7~10 d輕輕去掉套袋。雜交后觀察柱頭發育狀況，并根據敗育時期及時采集材料。雜交數量為982朵，采用重復授粉的方法。

1.3 雜交種胚處理

將采集回來的雜交種子去種莢，溫水浸泡3~4 h后剝去種皮，于流水下沖洗2 h，用吸水紙吸去多余水分后放置于無菌超凈工作臺上備用。

在無菌超凈工作臺上用75%酒精(30 s)、0.1% HgCl（8 min）、無菌水（2次2 min）對去種皮種子進行循環兩次的消毒處理，最后用無菌水攪拌清洗3 min（3次）。將消毒后的種子放在有濾紙的滅過菌的培養皿上，用鑷子和刀小心取出胚乳內靠近珠孔一側的幼胚，然后接種在啟動培養基中。

1.4 不同GA3、NAA、IBA和6-BA水平的設計

培養方法：以下各種培養基均加入蔗糖3.0%、瓊脂0.7%、pH調至5.8，并放置于培養室中常規條件（溫度24±1 ℃，光強2000 LX，光照時間12 h·d-1）下培養。

1.4.1 初代培養以MS為基本培養基，設置6組不同濃度的6-BA、NAA梯度組合，濃度配比如表1所示。每個處理接種9瓶，每瓶接3個種胚。定期觀察培養物污染、褐化、上胚軸膨大、真葉抽生率等生長表現。30 d后統計各項指標。

表1 初代培養基及激素組合

1.4.2 繼代培養分別以MS、1/2MS為基本培養基，設置7組不同濃度的IBA、6-BA、NAA、GA3梯度組合，濃度配比如表2所示。每個處理接9瓶，每瓶接3個胚。定期觀察幼苗污染、褐化、苗枯死數、胚軸膨大、真葉抽生等生長表現。30 d后統計各項指標。

表2 繼代培養基及激素組合

1.4.3 生根培養以MS為基本培養基，設置4組不同濃度的IBA、NAA梯度組合，濃度配比如表3所示。每個處理接種9瓶，每瓶接3個種胚。定期觀察幼苗生根數、根數、愈傷、葉片枯死、苗枯死數等生長表現。30 d后統計各項指標。

表3 生根培養基及激素組合

1.5 胚苗形態指標的統計與分析

測定胚苗抽真葉率、發芽勢、抽腋芽率、根數、胚軸膨大率、污染率、死亡率。

抽真葉率（%）=抽出真葉株數/該種培養基中接種胚的總數×100%；

發芽勢=該種培養基中的幼胚在發芽過程中發芽種胚數達到高峰期時正常發芽種胚總數/該種培養基中接種胚的總數×100%；

發芽率（%）=該種培養基中的幼胚發芽數/該種培養基中接種胚的總數；

抽腋芽率（%）=子葉或莖的腋芽抽出的胚數/該種培養基中接種胚的總數×100%；

胚軸膨大率（%）=胚軸膨大胚數/該種培養基中接種胚的總數×100%；

死亡率（%）=枯死苗數/該種培養基中接種胚的總數×100%；

生根率（%）=生根的幼苗數/該種培養基中接種胚的總數×100%。

2 結果與分析

2.1 不同初代培養基對雜交胚生長的影響

經過30 d的初代培養，結果如表4所示。雜種胚接種于初代培養基上3~5 d后子葉開始張開（如圖1-A），13 d左右子葉開始迅速變大變綠（如圖1-B），30 d上胚軸開始伸長,真葉抽出（如圖1-C、D）。在6種培養基中，胚膨大率由高到低依次為A-6（92.0%），A-5（74.1%），A-2（59.3%）；抽真葉率由高到低為A-1（54.2%），A-6（44.0%），A-2（33.3%）；褐化率由低到高依次為A-1（0），A-2（0），A-3（6.3%）；污染率整體偏低。綜合認為，A-6上的胚膨大率、抽真葉率、發芽勢相對于其它處理較高，且無污染率，是較好的初代培養基。

表4 不同初代培養基對雜交胚生長的影響

圖1 胚初代培養

2.2 不同繼代培養基對雜交胚繼代生長的影響

將各初代培養基上的幼苗轉至繼代培養基上培養30 d后，統計各形態指標，結果如表5所示。從幼苗生長狀況上來看，在7種培養基中，抽真葉率最高的為B-6（77.1%），其次為B-5（75.0%）；抽腋芽率最高的為B-6（62.9%），其次為B-5（57.1%）；污染率整體較低，除B-1（6.5%），B-4（9.7%）外，其它處理均無污染；胚軸膨大率最高為B-6（51.4%），其次為B-3（34.4%）；枯死率最低為B-6（37.1%），其次為B-5（39.3%）。其中，B-1，B-2，B-3，B-4上的幼苗真葉與莖抽出較快，但莖過長，有徒長趨勢，且易生出愈傷組織，容易褐化。綜上認為，B-6（如圖2-A），B-5（如圖2-B）上的幼苗生長狀況相對良好，具有較好的幼苗繼代效果。

表5 不同繼代培養基對雜交胚幼苗生長的影響

圖2 胚繼代培養

2.3 不同生根培養基對雜交幼苗生根生長的影響

將繼代培養基上的雜交幼苗轉入生根培養基中進行生根培養，培養15 d后，部分外植體胚根基部出現白色的根狀凸起，其后有定根出現，30 d后統計生根情況，結果如表6所示。

從幼苗生長狀況來看，C-1、C-2各生根一棵，根數均為2，其它處理無生根現象；C-1根長為1~2 cm，C-2根長0~1 cm；苗枯死率以C-1（51.9%）最低，其它處理均較高；C-1根原基突出較為明顯，C-4無根原基突出現象；C-4的褐化程度較高，但愈傷現象一般；C-1褐化程度較低且存在個體差異，但愈傷現象明顯。綜上所得，雖然C-1（如圖3）上的幼苗根長較長、根狀突起較多，褐化程度相比于其它處理輕，但是在培養過程中幼苗逐漸枯死，且愈傷現象嚴重，因此可以用作短期生根試驗培養基。

表6 不同培養基對雜種幼苗生根生長的影響

注：-表示無現象；+表示現象一般；++表示現象明顯；+++表示現象很明顯；+（-）表示存在個體差異。

Note：- indicates no phenomenon; + indicates general phenomena; ++ indicates phenomena; +++ indicates phenomena is obvious; +(-) indicates individual difference.

圖3 胚生根培養

3 討論

培養基種類不同，對胚的誘導分化也有所不同。在已經報道的牡丹組織培養研究中曾發現，雜種胚在MS基本培養基上的萌發率最高，適合作為牡丹雜種胚挽救的培養基[21]。植物在組織培養過程中，往往要添加一些植物調節劑來催化器官或組織的分化[7]。影響植物的萌發并不是單獨的激素因素起作用，激素在發揮其生理作用時并不是獨立的，而是互相影響，互相制約的[23]。高昌勇與紀慶亮分別在牡丹胚組織培養的研究結果中表明，添加6-BA的MS培養基中培養的牡丹胚的上胚軸、下胚軸可以正常生長，并且有些胚的芽萌動，真葉生長，可形成完整幼苗，NAA促進胚基部愈傷組織的形成，對胚生長有明顯的抑制作用[24,25]，與本實驗結果相似。

繼代培養基對雜種胚的繼代生長也至關重要。另外在試驗中發現，隨著GA3濃度的上升，胚苗出現了莖徒長、胚軸褐化和愈傷嚴重的現象，之后在培養基中添加1 g·L-1的PVP并沒有降低褐化的程度。此結果與何桂梅在兩種牡丹胚培養以及王雪玲在牡丹芍藥胚培養上的研究結果相似[17,26]。

此外，影響組培苗生根的因素有很多，培養基類型是其中較為重要的因素。一般而言，木本植物比草本植物難生根，來自成年樹的外植體比來自幼年樹的外植體難生根，生根使用的培養基多為MS或1/2 MS[20]。牡丹組培苗在一般情況下較難生根，這也是影響組培快繁技術應用于生產的難點，目前生根中的影響因素主要有繼代時間、激素類型、生根方法等[26]。殷麗青等在以牡丹幼胚為外植體誘導愈傷組織時，將體胚轉接培養后獲得了再生植株，但體胚的正常植株轉化率不高[27]。本試驗在生根培養30 d后發現，雖然有生根現象，但在培養過程中出現葉片枯死，胚軸形成愈傷且褐化嚴重的現象，推測其原因可能是地上部分莖葉生長過旺，消耗掉了大量碳水化合物，從而抑制了根系發育，由于不能生根及長期的離體培養導致芽處于休眠狀態，從而引起較多的葉片、幼苗枯死[17]。要提高離體胚培養的成苗率，需在培養時控制幼苗的長勢，降低褐化與愈傷程度，否則胚軸容易形成大量愈傷組織或莖徒長的現象，不利于胚苗后期的正常生長。

4 結論

本試驗以MS為基本培養基，附加不同濃度的植物激素6-BA與NAA，對雜交種胚正常生長的初代培養基進行了篩選后，認為A-6（6-BA 1.0 mg·L-1+ NAA 0.1 mg·L-1）的膨大率，發芽率及整齊度相對較高，是較好的初代培養基。在將初代培養基上的幼苗轉移至繼代培養基上，30 d后統計各項指標發現，各項指標最優的配比為B-6（IBA 0.2 mg·L-1+ GA30.2 mg·L-1+ 6-BA 0.2 mg·L-1），其次為B-5（IBA 0.1 mg·L-1+ GA30.3 mg·L-1+ 6-BA 0.2 mg·L-1）。這兩種培養基抽出真葉數較多，抽出側莖率也相對較高，具有較好的幼苗繼代效果。在生根培養的過程中發現，C-1（IBA 0.3 mg·L-1+ NAA 0.2 mg·L-1）的培養效果較好，根狀突起較多，根數及根長都相對較高，需在培養時控制幼苗的長勢，降低褐化與愈傷程度，以提高雜種苗質量及成苗率。

[1] 包滿珠.花卉學[M].第2版.北京:中國農業出版社,2003:489-499

[2] 郁書君,崔永強,楊梅.荷蘭的植物新品種保護與審定制度[J].中國農業,2009(1):14-16

[3] 魏冬霞,張滕,鄭嚴儀,等.芍藥愈傷組織中體細胞胚發育過程的組織細胞學觀察[J].植物研究,2018,38(1):56-63

[4] 王蒙蒙,卜祥藩,張倩,等.“鳳丹”離體快繁工廠化技術研究[J].分子植物育種,2018,16(2):526-534

[5] 戴思蘭,黃河,符建新,等.觀賞植物分子育種研究進展[J].植物學報,2013,48(6):589-607

[6] 文書生,成仿云,鐘原.‘正午’牡丹微繁殖體系的建立[J].植物科學學報,2016,34(1):143-150

[7] 王新,成仿云,鐘原.鳳丹牡丹鱗芽離體培養與快繁技術[J].林業科學,2016,52(5):101-110

[8] 周仁超,姚崇懷.紫斑牡丹胚培養與植株再生(簡報)[J].亞熱帶植物科學,2001,30(3):62,68

[9] 于茜茜,杜娟,王進茂,等.轉基因741楊雜種胚培養與植株再生[J].東北林業大學學報,2013,41(10):65-68

[10] 郝津藜,趙娜,石顏通.黃牡丹遠緣雜交親和性及雜交后代形態分析[J].園藝學報,2014,41(8):1651-1662

[11] 王杰,賈月慧,張克中,等.百合雌蕊中雜交親和性與不親和性差異表達基因分析[J].北京林業大學學報,2017,39(2):1000-1522

[12] Onay A, Pirinc V, Yildirim H,. In vitro micrografting of pistachio(.Siirt)[J]. Plant cell, tissue and organ culture, 2004(77):215-219

[13] Prem D,Singh S, Gupta PP,. High-frequency multiple shoot regeneration from cotyledonary nodes of guar (L. Taub)[J]. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Plant, 2003,39(4):384-387

[14] 李新玲,曲敏,閆玉清,等.影響小麥成熟胚培養及植株再生因素的研究[J].植物研究,2005,25(1):49-52

[15] 呂秀立,施季森.歐洲七葉樹的離體培養及快速繁殖[J].南京林業大學學報(自然科學版),2004,28(3):41-44

[16] 蔡漢權,賴鐘雄,林燕文,等.橄欖成熟胚培養研究[J].江西農業大學學報,2005,27(4):548-553

[17] 何佳梅.牡丹遠緣雜交育種及其胚培養與體細胞胚發生的研究[D].北京:北京林業大學,2006

[18] 安阿莉,蘇小玲,毛娟,等.紫斑牡丹幼胚離體培養試驗[J].甘肅農業大學學報,2009,44(6):63-68

[19] 朱向濤,王雁,彭鎮華,等.牡丹‘鳳丹’體細胞胚發生技術[J].東北林業大學學報,2012,40(5):54-58

[20] 張倩,王芳華.牡丹試管苗生根與移栽技術研究進展[J].園藝學報,2012,39(9):1819-1828

[21] 郭子霞.牡丹花粉貯藏及雜交幼胚的挽救[D].鄭州:河南農業大學,2012

[22] 王雪玲.芍藥牡丹組間遠緣雜交及‘鳳丹’胚培養研究[D].鄭州:河南農業大學,2014

[23] 李新風,鞏振輝,孫冬青.不同品種牡丹幾個生理參數的比較及其與組培褐化的關系[J].西北農業學報,2008,17(1):142-145

[24] 高昌勇.牡丹胚離體培養的研究[J].安徽農業科學,2009,37(19):8844-8865

[25] 紀慶亮,蔣素華,秦儀利.牡丹組織培養[J].安徽農業科學,2009,37(33):16253-16254

[26] 朱向濤,王雁,吳倩,等.江南牡丹莖段愈傷組織誘導與植株再生[J].核農學報,2015,29(1):56-62

[27] 殷麗青,周音,胡永紅,等.毒莠定對牡丹愈傷誘導及體胚發生的影響[J].核農學報,2013,27(8):1106-111

Study on the Embryo Culture of Peony and Paeonia Hybrids with Different Media Components

HE Dan1,2, SUXiao-di1, HE Song-lin1,2*, XIEMeng-jun1, ZHENG Yun-bing1, WANG Zheng1, LIU Yi-ping1

1.450002,2.453003,

At present, no efficient and stable system has been established for distant hybrid embryos of peony and paeonia, and few studies have been reported on the culture of hybrid ovules and young embryos. In this paper, the effects of different culture media on the germination of hybrid embryos were studied by culturing the hybrid embryos before the abortion of peony and Chinese peony. The varieties 'Fenyunu' ofand 'Feng Dan Bai' ofcultivar were used as parents to carry out thedistant hybridization. With MS as the basic medium, adding different concentrations of hormone combina-tions, after screening the primary culture medium for normal growth of hybrid embryos, the effects medium were screened. MS + 6-BA 1.0 mg·L-1+ NAA 0.1 mg·L-1+ 3% sucrose was better in primary culture medium with the better swelling rate and germination rate. The initial medium seedlings were transferred to subculture medium for 30d. The optimal ratio of each concentration was MS + IBA 0.2 mg·L-1+ GA30.2 mg·L-1+ 6-BA 0. mg·L-1+ 3%sucrose, followed by MS + IBA 0.1 mg·L-1+ GA30. mg·L-1+ 6-BA 0.2 mg·L-1+ 3% sucrose. After rootingculture for 30 days, MS + IBA 0.3 mg·L-1+ NAA 0.2 mg·L-1+ 3% sucrose had better culture effect, more rhizomes, higher root number and root length. The results showed that: different types of media can induce different differentiation of embryo.

Peony; Paeonia; hybrid embryo; medium component; embryo culture

S68

A

1000-2324(2019)05-0747-06

10.3969/j.issn.1000-2324.2019.05.003

2018-06-28

2018-07-17

國家自然科學基金(31600568);河南農業大學科技創新基金(30600965);河南農業大學博士啟動基金(30600408)

賀丹(1983-),女,博士,講師,主要從事園林植物遺傳育種. E-mail:dandan990111@163.com

Author for correspondence. E-mail:hsl213@yeah.com