葛花解酒活性與成分

陳花，徐德平

(江南大學 食品學院，江蘇 無錫,214122)

葛花為豆科植物野葛(Puerarialobata(Willd.)Ohwi)或甘葛藤(PuerariathomsoniiBenth)的干燥花[1]。《神農本草經》記載其性甘、味涼[2]，具有解酒護肝、抗腫瘤、降壓、降血脂等功效，長期以來主要被用作治療酒毒引發的嘔吐、發熱煩渴、不思飲食、吐血等不適癥狀，素有“千杯不醉葛花湯”的美名[3-6]。劉建書[7]等證實飲料中添加葛花醇提物可以顯著預防小鼠酒精急性中毒。葛花中主要化學成分有黃酮類、揮發油、皂苷類等，且異黃酮類為解酒的主要功效組分之一[8-10]，劉瑩等[11]研究表明葛花醇粗提物與葛花總異黃酮有良好的解酒效果；姚美村等[12]研究制備了葛花水提物、乙醇提取物，發現其中的異黃酮提取物對于酒精性肝損傷具有很好的保護作用。可見葛花的解酒功效研究還在處粗提物上，其解酒的功效成分及機理還未見相關的實驗證實。近年來，由于醉酒導致的社會和健康問題[13-14]引起了社會各界廣泛關注，解酒產品的需求越來越大，葛花因其價廉、高效、安全的優勢在解酒產品的開發上有更廣闊的前景。

本文采用小鼠急性酒精中毒模型，對葛花解酒功效成分進行系統篩選和分離研究，旨在明確葛花解酒的功效成分、以便對葛花進行更加充分，高效地開發利用。

1 實驗材料

1.1 材料與試劑

葛花，安徽亳州中藥市場；雄性ICR小鼠(體質量18～22 g)，上海斯萊克動物實驗動物有限公司；GF254型硅膠板，南京金留化玻璃儀器公司； AB-8型大孔吸附樹脂，天津南開大學化學工廠；ODS填料，Nacalai Tosoh Inc；MCI GEL填料，Mitsubishi Chemical Corporation；ADH、ALDH試劑盒，南京建成生物工程有限公司。

1.2 主要儀器設備

安捷倫7890B型氣相色譜儀，美國安捷倫科技有限公司；YF8-5型磨粉機，浙江省瑞安市永歷制藥機械有限公司；RAT-100 型萃取罐，無錫申科儀器有限公司；HH-2型數顯恒溫水浴鍋，上海市力辰科技有限公司；RE-52A旋轉蒸發器，上海亞榮科技有限公司； KB600型恒流泵，福建省新自立電機有限公司；ZF-90 型暗室紫外投射儀，上海顧順電光儀器廠；Avance 500 MHz型核磁共振儀，bruker公司。

2 實驗方法

2.1 葛花提取物的制備與粗分離

稱取10 kg葛花粉碎后過40目篩，置于100 L萃取罐中，按1∶10(g∶mL)料液比加入體積分數為80%的乙醇，60 ℃條件下攪拌提取3 h，過濾取濾液，濾渣按上述方法重復提取2次，合并3次濾液進行減壓濃縮得到醇提物。濾渣繼續按1∶10(g∶mL)料液比加入去離子水，60 ℃條件下重復攪拌提取1次，合并濾液減壓濃縮得葛花水提物(E)。

將葛花醇提物上AB-8型大孔樹脂(10 cm×150 cm)，用水、體積分數為30%、60%、95%的乙醇進行梯度洗脫，薄層色譜法(TLC)跟蹤檢測洗脫液中的成分，分別得到水洗脫物(A)、體積分數為30%乙醇洗脫物(B)、體積分數為60%乙醇洗脫物(C)、體積分數為95%乙醇洗脫物(D)，將各組分與水提物分別減壓濃縮并冷凍保存。

2.2 水提物和醇物解酒活性

取4周齡ICR雄鼠(25.0 g)60只，隨機分成6組，每組10只，適應性喂養5 d。于第6天經口給藥，每天1次，共7 d，各實驗組按1.0 g/(kg·d)劑量灌胃相應的提取物，空白組小鼠灌胃等體積飲用水[15-16]。于給藥的第7天進行小鼠行為學實驗[17-19]：實驗前12 h禁食不禁水，末次給藥(給水)后，30 min后空白組和各實驗組灌胃45°白酒，灌酒劑量0.17 mL/10 g，記錄給藥、給酒時間。

(1) 翻正反射實驗，觀察記錄各組小鼠翻正反射消失及恢復時間，計算醉酒潛伏期(自給酒至翻正反射消失時間)及醉睡時間(自翻正反射消失至恢復時間)，記錄醉酒動物數。翻正反射消失時間以小鼠背部向下保持30 s為標準；當小鼠活動自如、精神、靈活，即為翻正反射恢復。

(2) 攀附實驗，小鼠給酒后立即掛在垂直金屬網上，以小鼠掉落3次為終點，記錄小鼠在網上的攀附時間，反映小鼠酒后肌肉力量情況及醉酒狀態。

2.3 大孔樹脂洗脫活性組分的分離

將大孔樹脂洗脫物中有效解酒組分B上樣MCI柱(5 cm×100 cm)，用體積分數分別為20%、30%、40%、50%乙醇洗脫，結合TLC法顯色反應，分別得到B1、B2和B3、B4 4個部分。

2.4 MCI不同洗脫組分的解酒活性檢測

按2.2方法將MCI柱分離得到的B1、B2和B3、B4，進行小鼠翻正反射實驗和攀附實驗，檢測各組分的解酒功效。

2.5 解酒活性組分的分離與結構鑒定

將2.4中有解酒活性的B2組分經ODS-D(3 cm×100 cm)、ODS-AQ(3 cm×100 cm)色譜柱進行分離，用體積分數為20%乙醇溶劑梯度洗脫，TLC薄層法跟蹤檢測洗脫液，將Rf值和顯色反應一致的洗脫液合并，分離得3個單體化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，用氘代二甲亞砜溶解進行1H NMR和13C NMR等光譜測定。

2.6 單體化合物的解酒功效研究

2.6.1 單體化合物解酒功效的行為學測定

將3個單體化合物按2.2的方法進行翻正反射實驗，觀察記錄醉酒潛伏期及醉睡時間，判定3個單體化合物的解酒功效。

2.6.2 小鼠血液乙醇濃度及ADH、ALDH活性的測定

(1)血液乙醇濃度的測定。小鼠按2.2中的方法給藥，末次給酒1 h后，眼眶取血，置肝素抗凝試管中，GC法進行血醇濃度的檢測，色譜條件[20-21]為：N2流速2.0 mL/min；柱溫柱溫起始溫度75 ℃，以8 ℃ /min升到120 ℃，保持2 min，再以10 ℃/min升到150℃，保持2 min。頂空條件80 ℃，加熱時間300 s。

(2)ADH、ALDH活性的測定。在眼眶采血后，解剖小鼠取出肝臟，用生理鹽水浸洗，從每只小鼠肝臟左葉邊緣切下一小塊組織，用濾紙吸干后電子天平稱重。按照ELISA方法測定乙醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase,ADH)和乙醛脫氫酶(acetaldehyde dehydrogenase, ALDH)的活性。

2.7 數據處理

采用SPSS 24.0軟件進行處理，數據用(mean±SD)表示，采用單因素方差分析，0.01

3 結果與討論

3.1 葛花醇提物分離組分和水提物對小鼠醉酒時間的影響

水提物與大孔樹脂分離的不同洗脫組分對小鼠醉酒時間的影響如表1所示。

表1 葛花不同提取物對小鼠醉酒的影響Table 1 Effects of different extracts of Pueraria lobata on drunkenness in mice

注：*表示與空白對照組比較差異顯著(P<0.05)。下同。

由表1可知與空白組相比，A組醉睡時間差異顯著，但小鼠耐受時間較差(P>0.05)，B組醉酒潛伏期為(52.62±6.93)min，醉睡時間為(221.13±41.25)min，攀附時間為(11.32±1.64)min，具有顯著性差異(P<0.05)；C、D、E醉酒潛伏期與空白組相比無顯著性差異；說明葛花醇提物中體積分數為30%乙醇洗脫物對于緩解小鼠急性酒精中毒的效果最好。

3.2 MCI不同分離部分的解酒作用

葛花醇提物經大孔樹脂分離得到的體積分數為30%乙醇洗脫物具有顯著地緩解小鼠急性酒精中毒的效果，該部分經MCI分離后得到B1、B2和B3、B4，4個部分薄層色譜圖如圖1所示，4個部分的解酒作用見表2，從表2可見，B2組醉酒潛伏期、攀附時間最長，醉睡時間顯著縮短，與空白組有顯著性差異(P<0.05)；B1、B3、B4三組與空白相比效果沒有明顯提升，說明葛花解酒的功效成分主要集中在MCI柱層析體積分數為20%乙醇洗脫物中。

圖1 B1、B2、B3、B4薄層色譜Fig.1 TLC of B1, B2, B3 and B4

表2 MCI不同分離部分對小鼠醒酒時間的影響Table 2 Effects of different extracts of pueraria on intoxication in mice

組別小鼠數/只醉酒數/只潛伏期/min醉睡時間/min攀附時間/min空白組101021.4±3.27456.20±55.48 5.03±0.79B1組101029.3±6.99358.60±99.418.43±0.37B2組101073.18±19.3?223.00±36.82?12.43±1.27?B3組10941.65±11.65395.60±68.60 8.26±0.81B4組10837.22±6.95345.4±112.365.23±0.90

3.3 單體化合物的鑒定

MCI柱層析分離得到具有解酒活性的B2組分，經進一步分離得到3個主要化合物的單體。化合物I為白色結晶，可溶于水，易溶于甲醇、乙醇。從1HNMR(DMSO-d6，500 MHz)可見，δ8.49(1 H，s)、δ7.50(2 H，d，J=8.5)、δ7.43(1 H，s)、δ6.95(1 H，s)、δ5.10(1 H，s)，其中δ8.40處單峰H表明為異黃酮化合物，δ5.20為糖端基質子，δ3.20～3.70為糖上的H。從13C-NMR可見，該化合物共有22個碳信號，糖上含有6個C，1個—OCH3，剩下15個碳信號，可以認定化合物為黃酮化合物，結合135DEPT可知δ152.9為—CH信號，因此可得化合物為異黃酮類，通過以上分析并參照相關文獻[22-25]得出化合物為8-C-葡萄糖-鷹嘴豆素甲，化學結構見圖2。

圖2 化合物I、II、III的化學結構Fig.2 The chemical structures of compounds I, II and III

化合物II為淺褐色結晶，可溶于水，易溶于乙醇、甲醇。從1HNMR(DMSO-d6，500 MHz)可見，δ8.40(1 H，s)、δ7.43(2 H，d，J=8.5)、δ6.97(1 H，s)、δ6.87(2 H，d，J=8.5)、δ5.50(1 H，s)、δ5.20(1 H，s)，該化合物和化合物1相似，也為黃酮糖類成分，不同的是該化合物含有δ5.20和4.90兩個端基質子，說明含有二糖基。從13C-NMR可見，該化合物共有26個碳信號，糖上含有11個C，從碳信號來看一個為葡萄糖，一個為木糖。通過以上分析并與相關文獻[22-25]對比得出化合物為8-C-葡萄糖-O-木糖-染料木素，化學結構見圖2。

化合物III為不定性淺黃色粉末，可溶于水，易溶于甲醇、乙醇。從1HNMR(DMSO-d6，500 MHz)可見，δ8.40(1 H，s)、δ7.50(1 H，s)、δ7.43(2，d，J=8.5)、δ7.34(1 H，s)、δ6.87(2 H，d，J=8.5)、δ5.20(1 H，d，J=7.0)、δ3.91(3 H，s)，其中δ7.43和δ6.87中的4個H組成一個AA′BB′，表明該化合物有苯環對位取代，δ8.40處單峰H表明為異黃酮化合物二位上的H；δ7.50與δ7.34處2個H分別為黃酮A環上C6、C8位；δ5.20為糖端基質子，從偶合常數為7的數值看應為β連接；δ3.91處為甲氧基質子信號，δ3.20～3.70為糖上的H。13C-NMR數據見表3，從表3可見，該化合物共有22個碳信號，其中糖上含有6個C，1個—OCH3，余下15個碳信號，是黃酮類化合物，結合135DEPT可知δ153.0為叔碳信號，可以推斷化合物為異黃酮。通過以上分析并參照相關文獻[22-25]判斷該化合物為印度黃酮苷，化學結構見圖2。

表3 化合物I、II、III 的13C核磁共振數據Table 3 13C NMR spectroscopic data of compoundI,II and III

注：“-”表示不存在此位。下同。

3.4 單體化合物的解酒功效

各單體化合物解酒作用見表4，從表中可以看出與空白組相比，化合物Ⅰ組的醉酒潛伏期和醉睡時間均有顯著差異(P<0.05)；化合物Ⅱ組的醉睡時間與空白組有顯著差異(P<0.05)，但耐受時間沒有顯著提高；化合物Ⅲ組的醉酒潛伏期與醉睡時間均無顯著差異(P>0.05)。表明化合物Ⅰ為葛花中解酒的主要功能成分，化合物Ⅱ也能較好地縮短醉酒時間，化合物Ⅰ、Ⅱ是否具有協同作用還需進一步研究。

在小鼠血醇濃度方面，化合物Ⅰ組血醇濃度與模型組相比大幅下降且具有顯著差異，其余2組有所降低但無顯著效果。在ADH、ALDH活性方面，模型組2種酶活性略有升高，化合物Ⅰ組與空白組及模型組相比均具有顯著差異，其余2組酶活性提升方面無顯著效果。ADH、ALDH是體內參與乙醇代謝的主要酶，能在氧化型輔酶存在下將乙醇氧化為乙醛，再由乙醛分解成乙酸，從以上結果可以得出化合物Ⅰ通過提高肝臟ADH、ALDH活性，加速酒精的分解，降低機體血醇濃度達到解酒作用。

本文篩選到3個化合物，其中化合物Ⅰ解酒效果最好，化合物Ⅱ有一定效果，化合物Ⅲ無作用，從三者的化學結構來看都為異黃酮類，其中化合物Ⅰ與Ⅲ的C4′位都為—OCH3，但化合物Ⅰ、Ⅲ的糖鏈分別連在C8位和C7位，推測C8位的糖鏈影響了解酒作用的有無；化合物Ⅰ與Ⅱ C8位都存在糖鏈，但化合物Ⅱ C4′位為—OH，推測C4′位的基團影響了解酒活性的大小。

表4 單體化合物的解酒功效Table 4 Antidrunk effect of monomer compounds

4 結論

葛花經乙醇提取，大孔樹脂、MCI柱、ODS層析柱分離，結合解酒活性篩選，得到3種單體化合物，分別為8-C-葡萄糖-鷹嘴豆素甲、8-C-葡萄糖-O-木糖-染料木素、印度黃酮苷。其中化合物Ⅰ能顯著延長醉酒潛伏期、縮短醉酒時間,提高ADH和ALDH的活性,降低機體血醇濃度，具有極好的解酒效果；化合物Ⅱ有一定程度解酒作用；化合物Ⅲ在解酒方面則無作用。

本文首次分離并明確8-C-葡萄糖-鷹嘴豆素甲為葛花中解酒的功效成分，且由化合物的解酒效果及基團連接的不同分析推測該化合物中C8位和C4′位基團影響了解酒功效，而該位置的基團是直接決定或是通過和主環的相互作用影解酒效果還需要進一步科學驗證。且該化合物提高ADH和ALDH水平的機理也需進一步研究。