中高溫大曲曲塊部位間生化指標(biāo)的差異及變化規(guī)律

楊勇，李燕榮，姜雷，賈亞偉，王啟彪

(江蘇洋河酒廠股份有限公司，江蘇 宿遷，223800)

“曲是酒之骨”，大曲在濃香型白酒生產(chǎn)中起著至關(guān)重要的作用[1]。大曲作為一種富含多酶多菌的微生態(tài)制品，具有糖化、發(fā)酵、生香等功能，是傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵蒸餾大曲酒的重要物質(zhì)保障[2]，其品質(zhì)好壞直接決定了酒的風(fēng)格及檔次。作為塊狀曲，不同曲塊部位因通氣性、水分、溫度等微環(huán)境的差異而呈現(xiàn)不同的質(zhì)量[3]。

本文選取中高溫大曲為研究對象，將塊狀曲細(xì)分為曲皮、曲心及火圈，研究曲塊部位間生化性能的差異，結(jié)合在培菌發(fā)酵過程中變化規(guī)律和相關(guān)性的研究，進(jìn)一步剖析大曲的生化功能，為制曲工藝的調(diào)整、優(yōu)化甚至現(xiàn)代化提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與主要試劑

大曲樣品：中高溫大曲，選擇7月上旬入房發(fā)酵的四房曲進(jìn)行跟蹤研究。

HCl，NaOH，H2SO4，可溶性淀粉，CuSO4，酒石酸鉀鈉，亞鐵氰化鉀，醋酸，醋酸鈉，三氯乙酸，乳酸鈉，Na2CO3，酪素，乙醇，己酸，正庚烷等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

分析天平、生化培養(yǎng)箱、高壓蒸汽滅菌鍋、控溫水浴鍋、干燥箱、分光光度計(jì)等。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 取樣

1.3.1.1 成品曲曲塊部位間取樣

將成品大曲拆分為曲皮、火圈與曲心，分3批次，每批次取3房，每房10塊曲粉碎混勻作為1個樣本，每個部位9個樣本，取平均值。

1.3.1.2 大曲發(fā)酵過程取樣

對發(fā)酵期全流程進(jìn)行跟蹤并取樣。取樣時間分別為主發(fā)酵期(1、2、3 d)、潮火期(4、5、6、7 d)、大火期(8、9、10、11、13、15 d)、后火期(17、19 d)、養(yǎng)曲期(22、25、29、32、36 d)。采用五點(diǎn)取樣法，將曲樣分為曲皮樣和曲心樣，并依據(jù)軟硬情況，用粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，過40目篩備用。

1.3.2 檢測方法[4]

水分測定：采用快速烘干法，130 ℃ 烘1 h；利用酸、堿中和法測定酸度，以10 g曲消耗0.1 mol/L的NaOH溶液的毫升數(shù)表示，單位mmol/10 g曲；淀粉測定采用1∶4的HCl進(jìn)行加熱回流水解，用斐林試劑測定生成的糖；糖化力測定：采用斐林溶液滴定法測量，即1 g干曲在35 ℃、pH 4.6條件下反應(yīng)1 h，將可溶性淀粉分解為葡萄糖的毫克數(shù)(U/g)；發(fā)酵力測定：1 g曲樣在25 ℃糖化液中發(fā)酵48 h失重的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(g/10 g)；酯化力測定：0.8 g絕干曲在乙醇庚烷和己酸庚烷溶液中30 ℃條件下反應(yīng)72 h，用NaOH滴定未消耗的己酸；酸性蛋白酶活力測定：1 g曲在一定的溫度和pH值條件下，1 min水解酪素產(chǎn)生1 μg酪氨酸為1個酶活單位，以U/g表示。

1.4 數(shù)據(jù)處理

結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0軟件和Excel進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析、繪圖和相關(guān)性分析，顯著性水平設(shè)定在5%。

2 結(jié)果與分析

2.1 中高溫成品大曲不同部位間生化指標(biāo)的差異

由表1可知，大曲不同部位的理化、酶系及菌數(shù)都呈現(xiàn)顯著性差異。就理化特征而言，曲皮中的水分和酸度最小，其次是曲心，火圈最大；而淀粉在大曲不同部位中的含量差異則相反，曲皮略高于曲心。就酶活而言，曲皮的糖化力、發(fā)酵力最高，其次是火圈，曲心最低；酯化力則相反，曲皮最低，火圈次之，曲心最高；酸性蛋白酶活力則是曲皮遠(yuǎn)大于火圈和曲心，曲心略高于火圈。就菌數(shù)而言，曲皮中的細(xì)菌、霉菌和酵母數(shù)量都遠(yuǎn)高于其他部位，占絕對優(yōu)勢，曲心中的細(xì)菌最低，火圈中的霉菌數(shù)量則是最低的。

表1 成品大曲曲塊部位間生化指標(biāo)的差異Table 1 Difference of biochemical indexes between parts of finished daqu

不同字母表示同行具有顯著性差異。

2.2 中高溫大曲部位間生化指標(biāo)在發(fā)酵期的變化規(guī)律

2.2.1 曲心溫度變化規(guī)律

通過跟蹤大曲在培菌發(fā)酵過程中的曲心溫度，取平均值，結(jié)果如圖1所示。大曲發(fā)酵整體表現(xiàn)為前緩中挺后緩落，第8天頂火，占火8 d左右，后緩慢落火至48 ℃，此后進(jìn)入養(yǎng)曲期。就各階段而言：當(dāng)前季節(jié)，大曲培菌發(fā)酵在第4天并房，并房溫度48 ℃，并房過程中溫度稍有降低；第7天上架，上架溫度56 ℃左右；第8天達(dá)到頂火溫度，頂火溫度最高可達(dá)到60 ℃以上；占火8 d后進(jìn)入后火期，第20天落至48 ℃；而后進(jìn)入養(yǎng)曲期，養(yǎng)曲15 d后出房入庫貯存。

圖1 培菌發(fā)酵期曲心溫度的變化Fig.1 Temperature variation of Daqu during fermentation

2.2.2 水分變化規(guī)律

微生物的生長離不開水分，水的比熱高，能夠吸收微生物生長代謝過程中釋放的熱量，具有調(diào)節(jié)大曲品溫的功能[5]。由圖2可知,入房時，大曲水分在38%左右；發(fā)酵前10 d，曲塊表面水分、氧氣都很充足，好氧性微生物霉菌和酵母大量繁殖，曲溫也逐漸上升，結(jié)合翻曲與放門排潮等工藝操作，曲皮水分迅速減少，在第10天即大火第3天后就基本散失殆盡，低至12%左右；曲心水分則在發(fā)酵初期變化不大，當(dāng)曲塊溫度逐漸升高至大火期，曲皮水分散失嚴(yán)重，不能滿足微生物的繁殖所需，而此時曲心水分充足，曲心處“高濕”、“微氧”的環(huán)境極其有利于微生物的生長[6]，迫使微生物由曲皮轉(zhuǎn)向曲心內(nèi)部生長繁殖，曲心水分借助大曲穿衣過程中霉菌菌絲滲透形成的微孔通道外排，發(fā)酵10 d后呈遞減趨勢，出房時達(dá)到13%左右。在整個培菌發(fā)酵過程中，曲心的水分始終高于曲皮，水分是由外到里逐漸散失。

圖2 大曲培養(yǎng)過程中不同部位的水分變化Fig.2 Variation of water content in different parts of Daqu during culture

2.2.3 酸度變化規(guī)律

大曲酸度主要由兩方面形成，一方面是由于生酸微生物代謝形成的有機(jī)酸，另一方面來源于微生物通過三羧酸循環(huán)降解蛋白質(zhì)、脂肪和淀粉而形成的各種酸類物質(zhì)[5]。由圖3可知，大曲的制曲前期因代謝旺盛，發(fā)酵第4天出現(xiàn)一個產(chǎn)酸高峰，曲心酸度高達(dá)2.3 mmol/10 g曲左右，曲皮酸度則升至1.3 mmol/10 g曲左右；酸度的大小與微生物數(shù)量變化有很密切的關(guān)系，尤其與芽孢桿菌數(shù)量變化成正相關(guān)[7]；放門排潮后，曲皮酸度降至與入房時相當(dāng)，曲心酸度則維持高位平緩態(tài)勢；進(jìn)入大火期后，不耐熱的微生物大量死亡，曲心酸度也迅速遞減，曲皮酸度則先略降后又略升；下柴后，部分耐高溫芽孢桿菌開始生長繁殖，曲皮與曲心酸度小幅上升，伴隨著曲皮與曲心水分散失殆盡，微生物無法生存，曲皮與曲心酸度又緩落直至發(fā)酵結(jié)束。

圖3 大曲培養(yǎng)過程中不同部位的酸度變化Fig.3 Variation of acidity in different parts of Daqu during culture

2.2.4 淀粉變化規(guī)律

大曲的淀粉為微生物的生長繁殖提供了營養(yǎng)和前體物質(zhì)基礎(chǔ)，是大曲重要指標(biāo)之一。制曲發(fā)酵過程中的淀粉含量(折算為12%水分條件下)變化情況如圖4所示。入房時，大曲淀粉含量為64%左右；發(fā)酵初期，微生物大量生長與繁殖，淀粉被快速消耗利用，曲皮與曲心淀粉含量均呈遞減趨勢；直至進(jìn)入大火后，60 ℃左右的高溫使曲皮與曲心的微生物大量死亡，僅存能夠耐高溫的芽孢桿菌，因此，淀粉消耗很少而保持平緩趨勢直至發(fā)酵結(jié)束。整個發(fā)酵過程中，曲心淀粉含量始終略高于曲皮，這也與曲心微生物遠(yuǎn)低于曲皮相對應(yīng)。

圖4 大曲培養(yǎng)過程中不同部位的淀粉變化Fig.4 Variation of starch in different parts of Daqu during culture

2.2.5 糖化力變化規(guī)律

糖化力是糖化型淀粉酶將淀粉糖化生成葡萄糖的過程[5]。其活力的高低直接關(guān)系到釀酒過程中淀粉的轉(zhuǎn)化率。由圖5可知，入房時，大曲糖化力高達(dá)760 mg葡萄糖/(g曲·h)，這主要是因?yàn)榇笄巧习l(fā)酵，原料中小麥自身就含有一定的糖化酶；但原料自身糖化力易受溫度影響，極不穩(wěn)定；主發(fā)酵期，曲溫逐步上升，與糖化力相關(guān)的好氧性微生物霉菌在曲皮大量繁殖，原料自身攜帶的糖化力雖快速降低，但霉菌代謝生成的糖化酶則快速增長，導(dǎo)致曲皮的整體糖化力基本無變化，但曲心中霉菌很少，糖化力在入房2 d后即快速下降至30 mg葡萄糖/(g曲·h)左右；放門排潮后，曲溫進(jìn)一步上升，曲皮水分進(jìn)一步降低，霉菌代謝受到抑制，細(xì)菌開始占據(jù)主導(dǎo)優(yōu)勢，糖化力快速下降直至入房時的一半，曲心糖化力維持低位；進(jìn)入大火與后火期，微生物大量死亡，曲皮糖化力先緩升后緩降，變化幅度不大，曲心糖化力仍無變化；養(yǎng)曲期，隨著曲溫逐漸降到室溫，曲心部分尚有余水，少數(shù)耐干燥的紅曲霉菌等微生物尚能發(fā)育，曲皮糖化力開始回升并呈波動式變化，曲心糖化力也緩慢升高；出房時，曲皮糖化力為600 mg葡萄糖/g(曲·h)左右，曲心約為150 mg葡萄糖/(g曲·h)。就整個培菌發(fā)酵過程而言，結(jié)合成品曲不同部位的糖化力，不難發(fā)現(xiàn)大曲糖化力主要來自于曲皮。

圖5 大曲培養(yǎng)過程中不同部位的糖化力變化Fig.5 Variation of saccharifying power in different parts of Daqu during culture

2.2.6 發(fā)酵力變化規(guī)律

發(fā)酵力是大曲中的酶發(fā)酵糖產(chǎn)生CO2和生成酒精的過程強(qiáng)弱的評價，其變化主要是與酵母菌關(guān)系密切[5]。由圖6可知,在整個發(fā)酵過程中，曲皮與曲心發(fā)酵力的變化趨勢基本相同。發(fā)酵初始，大曲即具有高達(dá)12 g CO2/(10 g曲·48 h)的發(fā)酵力，這與釀酒區(qū)域存在大量野生酵母息息相關(guān)；發(fā)酵初期，曲塊溫度適宜，水分、氧氣充足，好氧微生物酵母大量增殖，在曲心中占絕對優(yōu)勢，曲皮中也大量繁殖，發(fā)酵力快速上升至最高峰，即22 g CO2/(10 g曲·48 h)左右；放門排潮后，隨著曲塊溫度的進(jìn)一步升高和水分的流失，酵母增殖受阻，因此發(fā)酵力快速下降；之后的環(huán)境條件更加苛刻，營養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)移和補(bǔ)充也較困難，酵母已處于難以生長的境地，死亡速度與繁殖速度相比時高時低，曲皮與曲心的發(fā)酵力呈波浪式緩升緩降，變化不大；發(fā)酵15 d后，曲塊落火，曲皮較曲心溫度低，導(dǎo)致酵母在曲皮中的數(shù)量高于曲心，發(fā)酵力也略高于曲心，這也與成品曲中曲皮酵母數(shù)量和發(fā)酵力顯著高于曲心一致。

圖6 大曲培養(yǎng)過程中不同部位的發(fā)酵力變化Fig.6 Variation of fermenting power in different parts of Daqu during culture

2.2.7 酯化力變化規(guī)律

酯化力是大曲自身經(jīng)發(fā)酵后固有的催化生酯的能力。由圖7可知，在培菌發(fā)酵過程中，曲皮與曲心的變化趨勢基本相同，前期波動幅度較大，而后呈緩升緩降后平穩(wěn)的趨勢；發(fā)酵初期，微生物在低溫高水分的條件下極易生長，入房后各類微生物便開始發(fā)育，在曲柸上大量生長繁殖，此時主要進(jìn)行數(shù)量增殖；在潮火中后期，各類微生物數(shù)量達(dá)到極限，開始啟動代謝酯化酶，酯化力快速上升，發(fā)酵第8天達(dá)到峰值；此時，曲塊已達(dá)到頂火溫度，不耐熱微生物大量死亡，霉菌和酵母的代謝受到抑制，酯化酶活力迅速降至谷底，發(fā)酵第10天后保持平緩；落火后，由于曲皮部分含水低，微生物很難生長，但曲心部分含水稍高，少數(shù)耐干燥的紅曲霉菌等微生物尚能發(fā)育，代謝生成酯化酶，曲心酯化力有所回升；養(yǎng)曲期間，曲心水分進(jìn)一步散失，微生物生存條件更加惡劣，酯化酶活力緩慢下降，出房時酯化力在10%左右。

圖7 大曲培養(yǎng)過程中不同部位的酯化力變化Fig.7 Variation of esterifying power in different parts of Daqu during culture

2.2.8 酸性蛋白酶活力變化規(guī)律

酸性蛋白酶能在低pH條件下有效水解蛋白質(zhì)，在白酒發(fā)酵過程中起協(xié)同作用，溶解發(fā)酵原料的顆粒，促進(jìn)微生物繁殖，分解蛋白質(zhì)生成香味物質(zhì)，分解酵母菌體蛋白，但活力過高卻會阻礙生料發(fā)酵，使酒焦苦味重。由圖8可知，在培菌發(fā)酵過程中，曲皮與曲心的酸性蛋白酶活力變化趨勢基本相同，潮火期開始迅速增長，大火期開始迅速下降，后期呈平緩趨勢；發(fā)酵初期，各種微生物可以吸收原料中自帶的氨基酸進(jìn)行生長繁殖；進(jìn)入潮火期后，隨著微生物的進(jìn)一步生長繁殖和原料自帶氨基酸的消耗，微生物靠自身代謝產(chǎn)生蛋白酶分解產(chǎn)生大量氨基酸來滿足微生物的增殖需求；隨著大曲進(jìn)入高溫發(fā)酵期，微生物數(shù)量銳減，氨基酸也參與美拉德反應(yīng)生成曲香風(fēng)味物質(zhì)，加上蛋白酶耐熱性較差，酸性蛋白酶活力迅速下降；后期隨著大曲水分的進(jìn)一步散失，微生物生長環(huán)境進(jìn)一步惡化，蛋白酶活力基本呈平緩趨勢。

圖8 大曲培養(yǎng)過程中不同部位的酸性蛋白酶活力變化Fig.8 Variation of acid protease activity in different parts of Daqu during culture

2.2.9 微生物區(qū)系變化規(guī)律

大曲的生產(chǎn)是開放式的，微生物來源十分廣泛，包括原料、環(huán)境、工具、操作等，群落十分復(fù)雜。根據(jù)微生物的形態(tài)和生理特性，主要包括細(xì)菌、霉菌與酵母菌[8]。由圖9可知，入房時以細(xì)菌為主導(dǎo)，由外源帶入；主發(fā)酵期，酵母大量增殖，在曲心中占絕對優(yōu)勢，曲皮中也大量繁殖，霉菌在主發(fā)酵后期開始大量增殖；潮火期，隨著溫度的進(jìn)一步上升，曲心中細(xì)菌開始占優(yōu)勢，主要是產(chǎn)酸細(xì)菌，曲皮則是由細(xì)菌和霉菌共同主導(dǎo)，因此，潮火期是霉菌大量繁殖的重要時期；進(jìn)入大火期后，曲皮與曲心都是細(xì)菌占絕對優(yōu)勢，以耐熱的芽孢桿菌為主，曲皮中仍有少量霉菌以孢子形式存在；落火及養(yǎng)曲期間，經(jīng)過高溫馴化，曲皮與曲心中仍然是細(xì)菌占絕對優(yōu)勢，霉菌與酵母很少。

圖9 大曲培養(yǎng)過程中曲皮與曲心微生物數(shù)量占比Fig.9 Variation of microbial number proportion between curved skin and inside of Daqu

2.3 相關(guān)性分析

大曲發(fā)酵過程中，生化指標(biāo)之間具有一定的相關(guān)性，且曲皮與曲心之間也有一定的差異性。如表2所示,糖化力與淀粉、細(xì)菌數(shù)量以及曲皮的水分和曲心的酵母之間都呈顯著正相關(guān)，發(fā)酵力與水分、淀粉、酵母以及曲皮細(xì)菌數(shù)量顯著正相關(guān)，發(fā)酵力、曲皮糖化力都與曲心溫度呈顯著負(fù)相關(guān)，說明隨著淀粉的消耗、曲皮水分的散失和曲心溫度的升高，糖化力和發(fā)酵力總體呈下降趨勢，進(jìn)而影響細(xì)菌和酵母數(shù)量的增殖，同時說明發(fā)酵力主要由酵母提供，與傳統(tǒng)理論一致；酯化力、酸性蛋白酶活力則與水分和淀粉之間相關(guān)性不大，說明其還與其他因素相關(guān)，如溫度、酸度等，表2顯示曲皮和曲心的酸性蛋白酶都與曲心溫度呈顯著正相關(guān)，曲心中的酸性蛋白酶還與酸度呈顯著正相關(guān)，曲皮中的酯化力和酸性蛋白酶活力顯著正相關(guān)，說明曲心溫度的升高和產(chǎn)酸微生物的生長代謝可以促進(jìn)酸性蛋白酶的代謝生成，代謝生成的有機(jī)酸也為酯化反應(yīng)提供前體物質(zhì)。

表2 大曲在發(fā)酵過程中生化指標(biāo)之間的相關(guān)性Table 2 The correlation between biochemical indexes of Daqu during fermentation

**.在0.01水平(雙側(cè))上顯著相關(guān);*.在 0.05水平(雙側(cè))上顯著相關(guān)。

3 結(jié)論與展望

本文通過將中高溫大曲拆分為曲皮與曲心，研究生化性能的差異及其在培菌發(fā)酵期間的變化趨勢，發(fā)現(xiàn)中高溫大曲部位間生化性能在成品曲和培菌發(fā)酵過程中都具有一定的規(guī)律性，且相互之間具有一定的相關(guān)性。主要結(jié)論如下：

(1)從結(jié)構(gòu)上細(xì)分了中高溫成品大曲的生化性能。曲皮的菌系最豐富，各類微生物均占優(yōu)勢，酶活也最高，但酯化力最低；曲心的細(xì)菌數(shù)量最低，糖化力與發(fā)酵力最低，酯化力最高；火圈的酵母和霉菌最少，以細(xì)菌為主，水分、酸度最大，酸性蛋白酶活力最低，其他性能居中。

(2)明晰中高溫大曲不同部位的生化性能在培菌發(fā)酵過程的變化規(guī)律。主發(fā)酵期，酵母大量增殖，發(fā)酵力速升，曲心糖化力速降、酸度快速增加，曲皮水分快速散失；潮火期，發(fā)酵力速降，酯化力和酸性蛋白酶活力上升，酸度平緩，曲皮中的霉菌先升至峰值后回落、水分進(jìn)一步降低；大火期，酶活和微生物數(shù)量都低，曲心的水分和酸度開始降低；落火后，酯化力、酸性蛋白酶活力和曲心糖化力有所回升；養(yǎng)曲期，糖化力繼續(xù)上升，酯化力與酸性蛋白酶活力緩降，曲心水分進(jìn)一步散失。

(3)研究發(fā)現(xiàn)中高溫大曲的糖化力主要來自于曲皮，發(fā)酵力主要形成于主發(fā)酵階段，酵母增殖也主要在主發(fā)酵階段，霉菌增殖主要在潮火階段，酯化力和酸性蛋白酶活力在大火初期達(dá)到峰值。

(4)相關(guān)性分析結(jié)果表明，糖化力與淀粉、細(xì)菌數(shù)量以及曲皮的水分和曲心的酵母之間都呈顯著正相關(guān)，發(fā)酵力與水分、淀粉、酵母以及曲皮細(xì)菌數(shù)量顯著正相關(guān)，發(fā)酵力、曲皮糖化力與曲心溫度呈顯著負(fù)相關(guān)，曲皮和曲心的酸性蛋白酶與曲心溫度呈顯著正相關(guān)，曲心中的酸性蛋白酶與酸度呈顯著正相關(guān)，曲皮中的酯化力和酸性蛋白酶活力顯著正相關(guān)。

為了全面了解中高溫大曲微生物群落及其多酶體系演變的內(nèi)在機(jī)理，還需要結(jié)合現(xiàn)代分子生物學(xué)方法和大曲功能微生物的分離鑒定與代謝分析，從而明晰中高溫大曲生化功能形成的內(nèi)在推動力，為制曲工藝優(yōu)化和制曲方法現(xiàn)代化提供理論借鑒。