貯藏溫度對高溫高壓海參體壁組織結構變化的作用

林琳，孫霄，侯虎

(中國海洋大學 食品科學與工程學院，山東 青島，266003)

海參屬于棘皮動物門，是一種重要的無脊椎動物[1]。刺參(Stichopusjaponicus)是海參中比較知名的品種，在中國主要生長在北方地區的海域中[2]。刺參在中國北方已有較大范圍的養殖，目前已經獲得了較高的產量，帶來了很大的經濟價值[3]。

由于酶和微生物的作用，新鮮刺參從海水中撈出來后極易自溶[4]。這一特殊性質對新鮮刺參的貯藏和運輸帶來了極大的影響和挑戰[5]。因此，實際工業生產上需要采取適當的加工方法，及時對新鮮刺參進行加工處理，從而延長貯藏期和貨架期。目前，市場上的刺參加工產品主要有淡干刺參、凍干刺參、鹽干刺參、即食刺參和刺參深加工產品[6]。其中，最受歡迎的是即食刺參。其優點是能較完整地保留刺參的營養物質和活性成分，并能保持刺參原有的風味和形態，不需發泡，食用方便；缺點是口感普遍較軟，保質期較短[7]。在即食海參的加工過程中，內源酶和微生物已經完全滅活，然而在貯藏過程中，仍然出現軟化、變黏的現象，這對產品的質量帶來了很大的負面影響。

因此，研究貯藏過程中高溫高壓海參非酶凝膠劣化(由非酶非微生物因素引起的凝膠化結構逐漸破壞的現象)的過程對工業化生產具有重要意義。CHEN等[7]的研究結果發現，高溫高壓海參體壁在4 ℃貯藏過程中逐漸降解，組織結構和膠原纖維被明顯破壞。PENG等[9]研究了高溫高壓海參在37℃貯藏過程中組織結構的變化情況。結果表明，高溫高壓海參體壁發生的非酶凝膠劣化現象是由水分遷移、膠原纖維斷裂和膠原蛋白降解引起的。本論文在已有研究的基礎上，研究4、20、37、50和60 ℃恒溫貯藏過程中高溫高壓海參組織結構的變化規律。探究了不同貯藏溫度對高溫高壓海參體壁組織結構變化的影響，以及貯藏過程中膠原纖維束和膠原蛋白分子結構發生的變化。從而為通過人工干預，有效地遏制組織結構的劣化速率提供理論依據，對延長刺參產品的貨架期具有重大意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

新鮮刺參(Stichopusjaponicus)，青島南山水產品市場。

平板計數瓊脂，青島海博生物技術有限公司；NaCl、戊二醛、無水乙醇，國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.2 儀器與設備

TMS-PRO型質構儀，美國FTC公司；HD-3A型智能水分活度測量儀，無錫市華科儀器儀表有限公司；LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫療器械廠；HPG-320H型人工氣候箱，哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司；JSM-840型掃描電子顯微鏡、JEM-2000EX型透射電子顯微鏡，日本JEOL公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品處理

新鮮刺參去內臟后于60 ℃水浴處理3 min，然后在沸水浴中煮沸10 min。去掉頭尾后按照“十字”進行4等分。單獨包裝后在121 ℃熱處理15 min。熱處理完成后，分別在4、20、37、50和60 ℃貯藏30 d，期間取樣并分析。

1.2.2 菌落總數的測定

采用國標GB4789.2—2016的方法測定高溫高壓海參中的菌落總數[10]。

1.2.3 TPA參數的測定

將樣品切割成小塊后放到測試臺上，采用5 kg的稱重傳感器。直徑4 mm的圓柱型探頭以50 mm/min的速度下壓，將樣品壓縮至原始高度的70%，循環操作2次[11]。分析樣品的硬度、彈性、黏聚性、咀嚼性、恢復性[12]。

1.2.4 水分含量的測定

采用恒溫干燥法(GB5009.3—2010)測定高溫高壓海參中水分含量。

1.2.5 水分活度的測定

將樣品剪碎后置于水分活度儀中，在25 ℃待平衡后讀取數據，測量時間為20 min[13]。儀器使用前用過夜放置的飽和NaCl溶液進行校正。

1.2.6 SEM圖像的測定

將樣品在2.5%(體積分數)的戊二醛溶液中4 ℃固定2 h[14]。梯度乙醇脫水后用臨界點干燥法進行干燥。離子濺射噴金后在掃描電子顯微鏡下觀察和拍照。

1.2.7 TEM圖像的測定

將樣品放入2.5%(體積分數)的戊二醛溶液中4 ℃固定3 h。包埋后用LKB超顯微儀進行切片(70 nm)，用醋酸鈾酰和檸檬酸鉛染色后在透射電子顯微鏡下觀察和拍照[15]。

2 結果與分析

2.1 貯藏過程中菌落總數的變化情況

由表1可知，高溫高壓熱處理過程中，微生物已完全失活；在不同溫度貯藏0～30 d，均未檢測到微生物。證明本實驗采用的處理條件和貯藏時間內，微生物已經被完全滅活。前期的研究結果表明，內源酶也已完全失活。因此，本實驗中高溫高壓海參組織結構的變化均是由非酶非微生物因素引起的。趙園園等[16]的研究結果發現類似的滅菌條件可以滅活仿刺參中的微生物，側面證明了此滅菌條件確實可以完全滅活微生物，排除了微生物對貯藏過程中仿刺參組織結構變化的影響。基于以上前提，本論文將進一步分析非酶非微生物因素對高溫高壓海參體壁組織結構變化的影響。

表1 高溫高壓刺參組織在不同溫度貯藏過程中菌落總數的變化Table 1 Changes of the total number of colonies of high temperature and high pressure sea cucumber during storage at different temperatures

注：ND表示未檢出。

2.2 貯藏過程中TPA參數的變化情況

由圖1-a和圖1-b可知，在不同溫度貯藏0～30 d時，各組的硬度和咀嚼性均呈逐漸減小的趨勢，表明貯藏溫度的差異并不能改變高溫高壓海參體壁組織非酶凝膠劣化的過程。然而，硬度和咀嚼性減小的速率與貯藏溫度呈顯著性正相關。推測原因是貯藏過程中高溫高壓海參體壁的組織結構逐漸被破壞和降解，且貯藏溫度的升高加速了組織被破壞的速率[17]。夏培浩等[18]研究了即食海參在25 ℃貯藏30 d過程中刺參品質的變化情況，結果表明，硬度和咀嚼性均呈下降的趨勢。馬桂蘭等[19]研究了刺參在4、20和37 ℃貯藏過程中TPA參數的變化情況。實驗結果證實貯藏過程中各組的硬度和咀嚼性均呈下降趨勢，且下降的速率與貯藏溫度呈正比。一階動力學方程：y=aebx，已經被廣泛應用于研究組織劣化的動力學過程[20-21]。采用此劣化模型，對不同溫度貯藏過程中高溫高壓海參的硬度和咀嚼性進行方程擬合，結果如表2所示。通過計算半數衰減周期(T50)，發現硬度和咀嚼性的T50值均隨著貯藏溫度的升高而顯著性下降，證明了硬度和咀嚼性的貯藏穩定性與貯藏溫度呈顯著性負相關。以上實驗結果表明貯藏溫度是影響高溫高壓海參硬度和咀嚼性的重要因素，且貯藏溫度與硬度和咀嚼性下降的速率呈顯著性正相關。

由圖1-c可知，當4 ℃貯藏時，高溫高壓海參組織的彈性并沒有發生明顯的變化；當20～60 ℃貯藏時，彈性隨貯藏時間的延長而減小，且減小的速率與貯藏溫度呈正比。由圖1-d和圖1-e可知，貯藏溫度與黏聚性和恢復性的變化沒有明顯的相關性；在整個貯藏過程中，黏聚性和恢復性的變化沒有規律性。ZHANG等[22]研究了高溫高壓海參組織在37 ℃貯藏過程中彈性和黏聚性的變化規律，得出結果與本文一致。

a-硬度；b-黏聚性；c-彈性；d-黏聚性；e-恢復性圖1 高溫高壓刺參組織在不同溫度貯藏時TPA參數的變化Fig.1 Changes of TPA parameters of high temperature and high pressure sea cucumber during differentstorage temperatures

表2 高溫高壓刺參組織在不同溫度貯藏過程中硬度和咀嚼性的擬合結果Table 2 The fitting results of the hardness and chewiness of high temperature and high pressure sea cucumber during storage at different temperatures

4 ℃20 ℃37 ℃50 ℃60 ℃硬度a6.940±0.1876.361±0.1636.217±0.3476.415±0.2486.494±0.333b-0.024±0.002-0.037±0.003-0.099±0.014-0.301±0.024-0.445±0.047r295.1497.1992.5998.1797.53T50/d28.8818.737.002.301.56咀嚼性a8.103±0.3467.592±0.2947.022±0.3177.377±0.1917.479±0.181b-0.034±0.005-0.072±0.007-0.137±0.014-0.444±0.023-0.787±0.040r288.3296.3696.3299.4199.62T50/d20.389.635.061.560.88

以上實驗結果表明貯藏溫度是影響高溫高壓海參質構特性的關鍵性因素。因此，可以通過降低貯藏溫度而顯著性減緩TPA參數的變化速率。

2.3 貯藏過程中水分含量和水分活度的變化情況

由圖2-a可知，在貯藏0～30 d的過程中，各組樣品的水分含量均呈先增大后基本不變的趨勢，且增大的速率與貯藏溫度呈顯著性正相關。在貯藏過程的后期，水分含量不再發生明顯變化且各組的水分含量之間并沒有顯著性的差異。原因可能是貯藏過程中，在高溫高壓滅菌過程中失去的水分子又重新回吸到高溫高壓海參的膠原纖維束中[23]。隨著貯藏溫度的升高，復水過程的速率顯著加快，因此水分含量增加的速率也顯著加快。當復水過程完成后，各組的水分含量不再發生顯著性變化。PENG等[9]研究了高溫高壓海參組織在37 ℃貯藏過程中水分含量的變化情況，研究結果同樣發現水分含量呈先增大后基本不變的趨勢。

水分活度反映了高溫高壓海參組織中水分子的存在狀態以及自由水與結合水的比例[24]。由圖2-b可知，隨著貯藏時間的延長，各組的水分活度均呈增大的趨勢，且增大的速率與貯藏溫度呈正比。推測原因是貯藏過程中高溫高壓海參組織不斷地從包裝袋內回吸水分，且貯藏溫度的升高加速了回吸速率。另一方面，高溫高壓海參的組織結構在貯藏過程中發生了非酶凝膠劣化現象，部分機械水和結合水轉化為自由水[25]。CHEN等[8]研究了高溫高壓海參在4 ℃貯藏過程中水分活度的變化情況，同樣發現各組的水分活度均隨著貯藏時間的延長而呈現增大的趨勢。

a-水分含量；b-水分活度圖2 高溫高壓海參組織在不同溫度貯藏時水分含量和水分活度的變化Fig.2 Changes of moisture content and water activity of high temperature and high pressure sea cucumber during different storage temperatures

2.4 貯藏過程中SEM圖像的變化情況

由圖3可知，高溫高壓海參在不同溫度貯藏過程中，組織結構均發生了非酶凝膠劣化現象。當在4 ℃和20 ℃貯藏時，體壁組織排列較為致密，結構較為完整，圖中未觀察到明顯的斷裂情況。當貯藏溫度升高到37 ℃時，組織結構被大程度地破壞。圖中可以觀察到明顯的斷裂現象，組織結構呈片層狀結構。在60 ℃貯藏過程中，片層狀結構被進一步破壞和降解，體壁組織呈現出泡沫狀結構。以上實驗結果表明膠原纖維束結構在貯藏過程中被逐漸破壞，且被破壞的程度與貯藏溫度呈正相關，并且不同的貯藏溫度并不能改變非酶凝膠劣化的過程。趙圓圓等[16,26]研究了即食刺參在25 ℃貯藏過程中微觀結構的變化情況，同樣發現刺參體壁中膠原纖維束的結構逐漸變得混亂。ZHANG等[22]采用VG染色法，研究了高溫高壓海參組織在37 ℃貯藏過程中膠原纖維束結構的變化情況，也發現膠原纖維束的結構被逐漸破壞和降解。

a-4 ℃；b-20 ℃；c-37 ℃；d-50 ℃；e-60 ℃圖3 高溫高壓海參組織在不同溫度貯藏5 d時SEM(×5 000)圖像的變化Fig.3 Changes of SEM (×5 000) images of high temperature and high pressure sea cucumber during different storage temperatures for 5 days

2.5 貯藏過程中TEM圖像的變化情況

新鮮的刺參組織在透射電鏡下可以觀察到明暗相間的D-周期結構，這是由膠原纖維的1/4錯位排列而引起[27]。由圖4可知，在不同的溫度貯藏5 d后，各組高溫高壓海參的微觀結構均發生了顯著性變化。在TEM圖像中均沒有觀察到D-周期結構，證明膠原纖維的結構已經被較大程度地破壞了。圖中僅能觀察到條帶狀結構，這是D-周期結構部分降解后的產物。在貯藏過程中，條帶狀結構被逐漸破壞和降解，且被破壞的程度與貯藏溫度呈顯著性正相關。當貯藏溫度升高到60 ℃時，圖中已經觀察不到條帶狀結構。組織結構發生了較大程度地斷裂和降解，呈現出片段化結構。由以上的實驗結果可知，隨著貯藏溫度的升高，高溫高壓海參組織被破壞的程度逐漸加重。

a-4 ℃；b-20 ℃；c-37 ℃；d-50 ℃；e-60 ℃圖4 高溫高壓海參組織在不同溫度貯藏5 d時TEM(×50 000)圖像的變化Fig.4 Changes of TEM (×50 000) images of high temperature and high pressure sea cucumber during different storage temperatures for 5 days

3 結論

高溫高壓海參組織在不同溫度貯藏過程中，均發生了非酶非微生物因素引起的劣化現象。微觀結構被破壞程度與貯藏溫度呈顯著性正相關，因此，可以通過降低貯藏溫度而有效地減小高溫高壓海參體壁結構的破壞程度，從而延長高溫高壓海參產品的貨架期。