Iturin A與肉桂精油復配提升櫻桃番茄貯藏品質

蔣夢曦，林福興，別小妹，呂鳳霞，陸兆新

(南京農業大學 食品科學技術學院，江蘇 南京，210095)

櫻桃番茄(Lycapersiconesculentumvar.cerasiformeAlef)是茄科番茄屬番茄栽培亞種中的一個變種[1]，又名圣女果、珍珠番茄，色澤鮮紅，酸甜可口，備受消費者喜愛[2]。盡管體積較小，櫻桃番茄含豐富的類胡蘿卜素、類黃酮和其他酚類化合物、維生素和礦物質等，是聯合國糧農組織優先推廣的四大水果之一[3-4]。作為一種呼吸躍變型果實，櫻桃番茄皮薄多汁，果實采后貯藏和運輸過程中容易遭受真菌病害而造成質量損失，這極大限制了櫻桃番茄產業的發展。其中軟腐病菌匍枝根霉(Rhizopusstolonifer)是番茄中重要的腐敗生物之一。低溫貯藏和化學殺菌劑能有效控制櫻桃番茄采后病害，延遲貨架期[5]，但低溫冷藏不足以殺死微生物，只是簡單地抑制它們在儲存期間的生長，化學保鮮劑對人體有毒副作用且容易造成環境污染，因此尋找綠色安全的生物源保鮮劑對控制櫻桃番茄采后病害，延長櫻桃番茄的貨架期和提高貯藏品質具有重要意義。

伊枯草菌素 A(iturin A)是屬于伊枯草菌素(iturin)家族的一種抗菌脂肽，具有強烈的抗真菌作用[6]，是一種安全且有潛力的生物源殺菌劑。LIU等[7]研究發現， iturin對鏈格孢菌(Alternariasolani)、鐮刀菌(Fusariumsambucinum)、匍枝根霉(Rhizopusstolonifer)和黃萎病菌(Verticilliumdahliae)等采后病菌有很好的抑制作用。WAEWTHONGRAK等[8]采用iturin對柑橘果實進行浸泡處理，發現用質量濃度為1 mg/mL的iturin處理可以有效控制柑橘果實綠霉病的發生。植物精油是芳香植物的高度濃縮提取物[9]，有特殊的香味，安全無毒。BOSQUEZ-MOLINA等[10]研究發現，百里香油體積分數僅為0.06% 時即可抑制炭疽病菌(Colletotrichumgloeosporioides)和匍枝根霉(Rhizopusstolonifer)的菌絲生長。國內有研究表明，姜精油與殼聚糖涂膜處理對圣女果[11]和草莓[12]有良好的保鮮效果；牛至精油能在常溫下延長圣女果的貨架期[13]。但是有關iturin A和精油復配對櫻桃番茄保鮮效果的研究未見報道。本課題組在前期研究中從野生蜂蜜篩選到1株解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)LZ-5，其發酵上清液對匍枝根霉的抑菌圈直徑可達到(14.23±0.44) mm。經過鑒定，發現該菌株中具有抑菌活性的物質為iturin A[14]。本試驗研究iturin A和植物精油對櫻桃番茄采后主要病害的抑制效果，通過測定腐爛率、失重率、硬度、維生素C(VC)含量等相關品質指標，探討iturin A和精油處理對櫻桃番茄貯藏品質的影響，以期獲得一種綠色安全的生物保鮮劑配方，從而減少化學保鮮劑的使用，并為櫻桃番茄采后保鮮提供理論依據和實踐指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

櫻桃番茄購于市場，選擇大小、成熟度一致，無機械損傷的果實，分組待用。

桉葉油、茴香油、肉桂油等,江西雪松天然藥用油有限公司;紅菲咯啉,上海阿拉丁生化科技股份有限公司；NaOH、三氯乙酸、乙醇、抗壞血酸、葡萄糖,國藥集團化學試劑有限公司。

解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)LZ-5、匍枝根霉(Rhizopusstolonifer) 均由實驗室保藏。

1.2 儀器與設備

Utimate3000高效液相分析系統，美國Dionex公司；恒溫恒濕箱，美國Stik公司；Orion 3-Star pH計，美國Thermo公司；PAL-1手持折光儀，日本Atago公司；CR-400 型彩色色差儀，日本Chroma Meter公司；FHM-5硬度計，日本Takemura Electric公司；UV-2450紫外可見分光光度計，日本Shimadzu公司；Centrifuge 5804R高速冷凍離心機，德國Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 Iturin A的提取

參照文獻[15]提取iturin A，用無菌水將其質量濃度調整為512 μg/mL。

1.3.2 最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration, MIC)測定

采用兩倍稀釋法[16]，以馬鈴薯培養液(PDB)培養基為稀釋劑，在無菌96孔板中分別加入50 μL不同濃度的iturin A和精油溶液，以加入等量PDB培養基的孔作為對照；隨后加入50 μL 1×104個/mLR.stolonifer孢子懸液。置于30 ℃培養箱培養48 h后觀察結果。以不長菌絲的第一個孔作為最小抑菌濃度。

1.3.3 Iturin A與肉桂精油最佳處理濃度的選擇

將櫻桃番茄用體積分數為0.1%的次氯酸鈉溶液浸泡2 min,用自來水清洗后，自然晾干。用消過毒的打孔器在櫻桃番茄赤道部位制造一個直徑5 mm、深2 mm的傷口，每個傷口分別加入50 μL以下液體：(1)無菌水；(2)64 μg/mL iturin A；(3)128 μg/mL iturin A;(4)256 μg/mL iturin A;(5)512 μg/mL iturin A。30 min后加入30 μL 1×104個/mLR.stolonifer孢子懸液，用PE塑料膜密封后貯藏于恒溫恒濕箱中(25 ℃、相對濕度85%～95%)。72 h后取出觀察并記錄發病率。20個果實為1個重復，每個處理3個重復。

肉桂精油的實驗方法同上，肉桂精油體積分數分別為0、0.05%、0.25%、1%、4%。

1.3.4 櫻桃番茄保鮮實驗

將櫻桃番茄分別浸泡在(A)水；(B)1%(體積分數)肉桂精油；(C)512 μg/mL iturin A;(D)1%(體積分數)肉桂精油+512 μg/mL iturin A中，每組分別用櫻桃番茄120個，重復3次。浸泡10 min，晾干后分裝入保鮮袋中，放入恒溫恒濕箱(30 ℃、相對濕度85%～95%)中保藏，分別于0、3、6、9、12、15 d取樣測定指標。每組另取20個櫻桃番茄放入保鮮袋，用于腐爛率和失重率的測定，每處理3個重復。

1.3.5 品質指標測定

腐爛率：果實表面出現腐爛或者霉斑即視作腐爛。計算如公式(1)所示：

(1)

失重率：采用稱重法進行測定。計算公式如下：

失重率/%=

(2)

色差：用CR-400色差計測定，在每個果實赤道部位選取2點進行測定，記錄a*、b*值，計算a*/b*的值，每個處理測定10次，取平均值[17]。

硬度：在果實赤道附近取相對的2點，用FHM-5硬度計測定硬度，每處理測定10次，取平均值。

可溶性固形物：用PAL-1便攜式手持折光儀測定，每個處理重復測定6次，取平均值。

可滴定酸：參考曹建康等[18]的方法，用0.01 mol/L的NaOH溶液滴定，結果以蘋果酸折算系數0.067計算，每處理測定3次。

維生素C：采用紫外分光光度計法[19]，每處理測定3次。

還原糖：采用3,5-二硝基水楊酸法測定[20]，每處理測定3次。

1.4 數據處理

用Excel 2010對數據進行處理和作圖，用SPSS 20對數據進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 Iturin A和8種植物精油最小抑菌濃度的測定

Iturin A對匍枝根霉的最小抑菌濃度為64 μg/mL。8種植物精油對匍枝根霉的最小抑菌濃度如表1所示。8種植物精油對匍枝根霉都有良好的抑菌效果，其中肉桂油、丁香酚、檸檬醛的MIC最低，是0.05%。綜合考慮價格等因素，選擇肉桂精油為復配原料。

表1 8種植物精油對匍枝根霉的MIC Table 1 MIC of 8 plant essential oils againstRhizopus stolonifer

2.2 Iturin A和肉桂精油對櫻桃番茄軟腐病的抑制作用

如圖1所示，隨著iturin A濃度的增加，櫻桃番茄軟腐病發病率逐漸降低。當iturin A質量濃度為512和1 024 μg/mL時，櫻桃番茄軟腐病發病率沒有顯著差異(P>0.05)。因此，iturin A最佳處理質量濃度為512 μg/mL。

圖1 Iturin A對櫻桃番茄軟腐病的抑制作用Fig.1 Inhibition of iturin A on soft rot of cherry tomatoes

如圖2所示，肉桂精油濃度越高，櫻桃番茄桃軟腐病的發病率越低。

圖2 肉桂精油對櫻桃番茄軟腐病的抑制作用Fig.2 Inhibition of cinnamon essential oil on soft rot of cherry tomatoes

當肉桂精油體積分數為4%時，櫻桃番茄發病率約為3.3%，比對照組低95%。但是，當用4%肉桂精油處理櫻桃番茄時，櫻桃番茄表皮發生了明顯的皺縮，表明4%肉桂精油對櫻桃番茄的品質有一定負面的影響，而1%肉桂精油對櫻桃番茄果實的表皮沒有顯著的負面影響，因此，選擇肉桂精油最佳處理體積分數為1%。與iturin A相比，肉桂精油對櫻桃番茄軟腐病的直接抑制效果較差，8 MIC濃度的iturin A就能使櫻桃番茄軟腐病發病率降低約90%，而肉桂精油濃度到達20 MIC才有相近的效果。

2.3 Iturin A與肉桂精油復配對櫻桃番茄品質指標的影響

2.3.1 Iturin A與肉桂精油復配對櫻桃番茄腐爛率的影響

貯藏期櫻桃番茄果實的腐爛率是直觀反映果實貯藏效果的重要指標。如圖3所示，隨著貯藏時間的延長，處理組和對照組果實的腐爛率均呈上升趨勢。貯藏至15 d，對照組果實腐爛率高達55 %，肉桂精油組果實的腐爛率為45%，而iturin A組和iturin A+肉桂精油組果實腐爛率僅為17.35%和7.18%。進一步比較發現，在貯藏6～15 d內的同一貯藏時間，iturin A組和iturin A+肉桂精油組果實的腐爛率顯著(P<0.05)低于對照組果實。

A-CK；B-1% 肉桂精油；C-512 μg/mL iturin A；D-1% 肉桂精油+512 μg/mL iturin A圖3 不同保鮮物對櫻桃番茄腐爛率的影響Fig.3 Effect of different preservatives on the rotting rate of cherry tomatoes

2.3.2 Iturin A與肉桂精油復配對櫻桃番茄失重率的影響

由圖4可知，隨著貯藏時間的延長，各組櫻桃番茄的失重率逐漸增加，但是對照組櫻桃番茄的失重率上升最為明顯。對照組果實失重率在貯藏0～3 d內變化不大，6～15 d內快速上升。肉桂精油單獨處理的櫻桃番茄也是從第6天開始失重率逐漸升高，但是增加的幅度顯著低于對照組(P<0.05)。iturin A處理組與復配組失重率緩慢上升，貯藏至第15天時，失重率分別是0.81%和0.72%，兩組之間差異不顯著(P>0.05)。Iturin A+肉桂精油組失重率比對照低92%，與對照存在極顯著差異(P<0.01)。說明iturin A單獨處理或者與肉桂油復配處理能夠有效延緩櫻桃番茄果實水分的蒸發，降低其質量損失。

A-CK；B-1% 肉桂精油；C-512 μg/mL iturin A；D-1% 肉桂精油+512 μg/mL iturin A圖4 不同保鮮物對櫻桃番茄失重率的影響Fig.4 Effects of different preservatives on the weight loss rate of cherry tomatoes

2.3.3 Iturin A與肉桂精油復配對櫻桃番茄色差的影響

a*表示櫻桃番茄的紅色度，b*表示櫻桃番茄的黃色度，a*/b*的值越大表示櫻桃番茄果實越紅，越成熟，因此可將a*/b*作為評價櫻桃番茄成熟的一種標志[21]。

A-CK；B-1% 肉桂精油；C-512 μg/mL iturin A；D-1% 肉桂精油+512 μg/mL iturin A圖5 不同保鮮物對櫻桃番茄色差的影響Fig.5 Effects of different preservatives on a*/b* of cherry tomatoes

從圖5可以看出，在貯藏期間，各處理組果實的色差整體都是呈現上升的趨勢。對照組和肉桂精油組在前6 d上升比較快，6 d以后上升比較緩慢，而iturin A組和iturinA+肉桂精油組前3 d上升比較快，之后緩慢上升。前3 d各組色差沒有顯著差異(P>0.05)，從第6天開始，iturinA組和iturinA+肉桂精油組色差都顯著低于對照組(P<0.05)。其中，iturin A+肉桂精油組的色差最小，至第15天時，該組色差比對照組低約18%，表明iturin A與肉桂油復配能夠延緩櫻桃番茄果實的成熟，延長其貨架期。

2.3.4 Iturin A與肉桂精油復配對櫻桃番茄硬度的影響

從圖6可以看出，在整個貯藏過程中，櫻桃番茄的硬度呈現出下降的趨勢。各處理組櫻桃番茄的硬度下降較慢，從第3天起，iturin A組和iturin A+精油組的硬度始終顯著高于對照組(P<0.05)。前6天，對照組和肉桂精油組果實的硬度下降較快，后期下降較慢。精油處理組果實硬度僅有6 d和12 d顯著高于對照組(P<0.05)。貯藏第15天，iturin A和iturin A+肉桂精油組果實的硬度分別比對照組高32%和63%，差異極顯著(P<0.01)。說明iturin A和iturin A+肉桂精油復配處理能夠較好地維持櫻桃番茄果實的硬度。

A-CK；B-1%肉桂精油；C-512 μg/mL iturin A；D-1%肉桂精油+512 μg/mL iturin A圖6 不同保鮮物對櫻桃番茄硬度的影響Fig.6 Effects of different preservatives on the hardness of cherry tomatoes

2.3.5 Iturin A與肉桂精油復配對櫻桃番茄可溶性固形物含量的影響

果實中可溶性固形物的變化反映了成熟過程中果實的酸度向甜度轉化的程度。如圖7所示，除對照組外，總體上，櫻桃番茄的可溶性固形物含量呈現下降的趨勢。對照組的可溶性固形物含量在貯藏前期呈下降趨勢，第9天時突然升高，且貯藏至第12天和15天時，對照組可溶性固形物含量顯著高于其他處理組(P<0.05)，可能是由于第9天之后果實開始腐爛，失水率增加，使得單位體積的可溶性固形物含量增加。精油組的可溶性固形物含量在前9 d下降的趨勢相對較慢，后期果實開始腐爛，可溶性固形物含量快速下降。貯藏后期，Iturin A組和iturin A+肉桂精油組的可溶性固形物含量有所波動，但基本保持穩定，復配組高于iturin A組，但是兩者之間沒有顯著性差異(P>0.05)。Iturin A與肉桂精油復配處理對櫻桃番茄可溶性固形物含量沒有負面影響。

A-CK；B-1% 肉桂精油；C-512 μg/mL iturin A；D-1% 肉桂精油+512 μg/mL iturin A圖7 不同保鮮物對櫻桃番茄可溶性固形物含量的影響Fig.7 Effects of different preservatives on the content of total soluble solids of cherry tomatoes

2.3.6 Iturin A與肉桂精油復配對櫻桃番茄可滴定酸含量的影響

果實中的有機酸對其風味有著重要的作用，可滴定酸含量的高低反映了果實的成熟程度，櫻桃番茄中最主要的有機酸是蘋果酸。貯藏期間，各處理組可滴定酸含量的變化趨勢如圖8所示。

A-CK；B-1% 肉桂精油；C-512 μg/mL iturin A；D-1% 肉桂精油+512 μg/mL iturin A圖8 不同保鮮物對櫻桃番茄可滴定酸含量的影響Fig.8 Effects of different preservatives on the content of titratable acid of cherry tomatoes

對照組和精油組果實的可滴定酸含量在貯藏前6 d處于下降的趨勢，可能是由于果實有機酸一部分轉化為糖類物質，一部分作為呼吸底物被消耗。第6天之后，對照組和精油組果實的可滴定酸含量逐漸升高，可能是由于后期果實開始腐爛，過度蒸騰失水，組織中汁液濃縮，致使可滴定酸相對含量增加[22]。Iturin A組和iturin A+肉桂精油組果實的可滴定酸含量在整個貯藏期間都是呈下降趨勢，復配組下降趨勢較為平緩。貯藏至第15天時，復配組可滴定酸含量比iturin A組高16%(P<0.05)。說明iturin A與肉桂精油復配能夠減緩櫻桃番茄可滴定酸含量的下降，更好地保持果實的品質。

2.3.7 Iturin A與肉桂精油復配對櫻桃番茄VC含量的影響

VC是一種重要的營養物質，普遍存在于各類水果中，同時VC也是一種抗氧化劑，可以清除果實內的活性氧[23]。除復配組外，其余3組果實的VC含量在第3天顯著降低，后期處于波動狀態。Iturin A+肉桂精油組果實的VC含量沒有明顯的趨勢，第3天時顯著升高，之后一直處于波動狀態，但是一直保持高水平，含量始終顯著高于其他3組(P<0.05)。可能是由于iturin A與肉桂油結合處理使得櫻桃番茄內部有關VC的代謝加強，使其一直維持高水平的VC含量。貯藏至第15天時，復配組VC含量高達(34.91±1.10) mg/100 g，比對照高65%。說明iturin A與肉桂油結合能使櫻桃番茄VC含量保持在較高水平，有利于櫻桃番茄的保藏。

A-CK；B-1% 肉桂精油；C-512 μg/mL iturin A；D-1% 肉桂精油+512 μg/mL iturin A圖9 不同保鮮物對櫻桃番茄VC含量的影響Fig.9 Effects of different preservatives on the content of vitamin C of cherry tomatoes

2.3.8 Iturin A與肉桂精油復配對櫻桃番茄還原糖含量的影響

還原糖是櫻桃番茄可溶性糖的主要部分。如圖10所示，4組還原糖含量總體保持相對平穩，中間略有波動。呈現這種趨勢可能是由于在后熟及衰老過程中，單糖不斷被消耗，同時在許多代謝酶的催化下，淀粉等高分子多糖類物質被水解為寡糖和單糖類物質[24]，從而導致還原糖含量比較穩定。對照組果實還原糖含量在第3天有明顯下降，隨后又升高，第9天之后又下降。肉桂精油組和iturin A組果實的還原糖含量則是表現出波浪式梯度。不同的是，iturin A+肉桂精油組還原糖含量在前3 d有所升高，第3天之后又緩慢下降。但是除第9天外，該組還原糖含量始終顯著高于其他3組(P<0.05)，其中第6天、第15天復配組還原糖含量比對照組分別高14.7%、10%。說明iturin A與肉桂精油復配能夠較好地維持櫻桃番茄的還原糖含量。

A-CK；B-1% 肉桂精油；C-512 μg/mL iturin A；D-1% 肉桂精油+512 μg/mL iturin A圖10 不同保鮮物對櫻桃番茄還原糖含量的影響Fig.10 Effects of different preservatives on the content of reducing sugar of cherry tomatoes

3 討論與結論

本實驗研究了iturin A與肉桂精油復配對櫻桃番茄貯藏品質的影響。實驗結果表明，iturin A和肉桂精油可顯著降低櫻桃番茄果實軟腐病的發生率，這是由于iturin A和肉桂精油對匍枝根霉具有良好的抑制效果。512 μg/mL iturin A單獨處理能抑制櫻桃番茄果實的腐爛，減少質量損失，減緩色差的增加，保持較高的硬度，這可能是由于iturin A具有廣譜抗真菌性，能夠清除自由基和金屬螯合物，阻止過氧化物對細胞的毒性損傷[25]，這與李蒙等[26]、牛耀星等[27]的研究結果一致。體積分數為1%的肉桂精油處理櫻桃番茄能減少果實的失重率，這是由于精油的疏水性能夠抑制水分的流失。SNCHEZ-GONZLEZ等[28]研究發現，佛手柑精油處理葡萄也能顯著減少葡萄的質量損失。但是肉桂精油處理的櫻桃番茄果實腐爛率、可溶性固形物含量、可滴定酸含量等指標與對照沒有顯著差異(P>0.05)或者比對照更差，這可能是由于精油濃度過高，對櫻桃番茄果實造成了不良影響。周漢軍等[29]的研究也表明，1%藍桉葉精油對砂糖橘又輕微藥害，能縮短果實的貯藏期。本研究發現，iturin A與肉桂精油復配處理的櫻桃番茄在第15天時腐爛率為7.18%，失重率僅為0.72%。張彪等[30]用20 g/m3ClO2處理櫻桃番茄果實，貯藏第15天時，櫻桃番茄腐爛率和失重率分別達到27%和5.8%；范小靜等[31]用檸檬油微乳劑處理櫻桃番茄15天后，櫻桃番茄壞果率為14.13%，與這些研究結果相比，iturin A與肉桂精油復配能更有效地抑制櫻桃番茄的腐爛變質。果實硬度的降低通常與細胞結構、細胞壁組成和細胞內物質的變化有關，這些生理變化通過調節果膠酶和多聚半乳糖醛酸酶的活性，加劇果實軟化[32]。在整個貯藏過程中，各組櫻桃番茄果實硬度持續降低，其中iturin A與肉桂精油復配處理的果實硬度下降最為緩慢，表明iturin A與肉桂精油復配能抑制相關酶的活性，減緩果實硬度下降，這與余定浪等[33]、梁蕓志等[34]的研究結果一致。但是iturin A與肉桂精油復配使櫻桃番茄保持高水平的還原糖和VC含量的機理，需要進一步的研究。

本研究表明，512 μg/mL iturin A與1%(體積分數)肉桂油復配能顯著降低櫻桃番茄果實的腐爛率，減少失重，減緩色差的提高和硬度的降低，減少可滴定酸、VC、還原糖含量的損失，是一種具有潛力的生物保鮮劑。