常壓室溫等離子體誘變篩選高產多糖猴頭菌株的研究

楊 珊，楊 焱，李巧珍，吳 迪，楊瑞恒，汪文翰，張赫男*

（1農業部南方食用菌資源利用重點實驗室，國家食用菌工程技術研究中心，上海市農業科學院食用菌研究所，上海201403；2上海海洋大學食品學院，上海201306）

猴頭菌（Hericium erinareus）是我國著名的食藥用真菌，與熊掌、海參、鱉魚翅并列為“四大名菜”，并有“山珍猴頭，海味燕窩”的美稱［1］。大量研究表明，猴頭菌不僅對消化系統疾病具有療效，還具有增強免疫、抗腫瘤、抗衰老、降血糖、保護神經和抗菌等作用［2］。猴頭菌的化學成分非常復雜，有多糖、甾醇類、萜類、脂肪酸、酚類等化合物，其中多糖是研究最多的成分之一。猴頭菌的主要活性物質為猴頭多糖［3］。大量的藥理、藥效研究證明，猴頭菌子實體多糖和菌絲體多糖都具有抗腫瘤、抗氧化、提高免疫力、降血糖、抗疲勞等功效［4-8］。猴頭菌多糖現在主要來源于栽培的子實體和固體發酵菌絲體［9］，但菌株的退化致使其多糖含量不高且不穩定，影響了猴頭菌類產品的功效與質量，因此優良猴頭菌株的獲得尤為重要。

物理誘變技術是微生物育種中獲得高效、高產菌株的重要方法之一［10］。利用物理誘變篩選高效菌株，在優化食品微生物性能、提高其產品質量方面具有廣闊的應用前景［11］。目前，利用紫外誘變進行微生物誘變育種研究報道最多，但紫外誘變的材料易發生光修復［12］，影響誘變結果，因此采用高效、新穎的誘變方法尤為關鍵。常壓室溫等離子體（ARTP）誘變技術是一種新型的誘變技術，具有誘變溫度低、無需真空環境、等離子體射流均勻等特點，與傳統微生物誘變相比，操作安全性高，且對環境無污染［13］。目前，該技術主要應用于酵母大腸桿菌及刺糖多孢菌等多種微生物的選育并取得了良好效果［14］，但在猴頭菌的選育中尚未有報道。本研究首次利用ARTP誘變技術對猴頭菌原生質體進行誘變，以期獲得性狀穩定遺傳、高產多糖的猴頭菌株，為猴頭菌類產品的深度開發和推廣奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

供試猴頭菌株0605由上海市農業科學院食用菌研究所提供。

1.1.2 培養基

PDA培養基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，水1 000 mL，pH 5.5。種子培養基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，KH2PO42 g，MgSO4·7H2O 1 g，水1 000 mL。發酵培養基：酵母粉10 g，葡萄糖20 g，KH2PO42 g，MgSO4·7H2O 1 g，水1 000 mL。再生培養基：PDA培養基中加入甘露醇，使培養基中甘露醇濃度為0.6 mol/L。

1.1.3 試劑

溶壁酶購自廣東微生物所；崩潰酶、Trolox、ABTS、TPTZ均購自美國Sigma公司；七水硫酸亞鐵、氯化鈉、Tris-鹽酸、乙二胺四乙酸、苯酚、氯仿、異戊醇、甘露醇均購自國藥試劑公司。

1.1.4 儀器

Ⅱ型ARTP誘變儀（無錫源清天木生物科有限公司）、ISG-180恒溫培養箱（Thermo Scientic公司）、DKY-Ⅱ回轉式恒溫調速搖床柜（上海杜科自動化設備有限公司）、恒溫混勻搖床（ZWY-240，上海智誠分析儀器制造有限公司）、Allegratm25R Centrifuge離心機（美國Beckman公司）、FA2004N分析天平（上海精密科學儀器有限公司）、SS-325高壓蒸汽滅菌鍋（TOMY公司）、Veriti PCR儀（基因有限公司）、DYY-GC電泳儀（北京市六一儀器廠）、G：BOX凝膠成像儀（Syngene）、Synergy HT多功能酶標儀（美國Bio-Tek公司）、微孔板發光檢測儀（美國Bio-Tek公司）。

1.2 方法

1.2.1 猴頭菌原生質體制備

取PDA平板上生長旺盛的猴頭菌菌絲，接種于種子培養基中，26℃黑暗靜止培養10 d。取種子培養基中菌絲體于離心管中，用無菌水清洗2次，濾紙吸干水分。按照每300 mg菌絲加入1 mL酶液的比例［15］置于恒溫混勻搖床中進行酶解。酶解結束后采用G3砂芯漏斗過濾菌液，以除去殘留菌絲體。濾液5 000 r/min離心10 min，棄上清，所得沉淀用0.6 mol/L甘露醇穩滲液沖洗，得到的原生質體溶于適量的0.6 mol/L甘露醇穩滲液中，用血球計數板計數。

1.2.2 常壓室溫等離子體誘變處理時間的研究

取1×107個/mL的猴頭菌原生質體，加入等體積的10%（V/V）甘油做保護劑，取20μL原生質體均勻涂于載片上，置于氦氣處理源下，處理距離為2 mm，功率為120 W，氣流量為8 SLM，處理時間為0 s、10 s、20 s、30 s、40 s、50 s。計算原生質體在不同處理劑量下的致死率。

1.2.3 猴頭菌原生質體ARTP誘變及優勢菌株初篩

利用ARTP對稀釋到適當濃度的猴頭菌原生質體懸浮液進行輻照。輻照結束后，迅速將100μL原生質體樣品涂布于突變體篩選平板上。試驗在暗室中進行，為避免光修復，使用紅光照射，每輪試驗涂布100個平板，連續5輪。將誘變后的猴頭菌原生質體于26℃恒溫黑暗培養，24 h后去黑暗繼續26℃恒溫培養，5 d后對再生單菌落進行考察。每輪輻照后，以未經過ARTP輻照的再生菌株為對照，將再生速度快、菌絲致密的優勢再生菌株進行傳代培養，持續5代。經過5代篩選，獲得性狀優良、遺傳穩定的菌株。

1.2.4 優勢菌株的復篩

將篩選到的菌絲生長速度快且遺傳穩定的優勢突變菌株進行搖瓶發酵，發酵獲得的菌絲體經無菌水洗滌3遍，5 000 r/min離心10 min，得到濕菌絲，冷凍干燥后獲得干菌絲，測定其生物量。搖瓶發酵所得的干菌絲經粉碎機粉碎成菌絲體粉末，與10倍體積的95%（V/V）乙醇混合靜置過夜，過夜混合物10 000 r/min離心10 min，棄上清后得到的勻漿用蒸餾水進行稀釋，以1∶10的料液比在100℃沸水浴中提取2 h，得到的混合液10 000 r/min離心15 min并收集上清液，將離心后剩下的勻漿繼續以1∶10的料液比添加蒸餾水，在100℃沸水浴中提取2 h，反復3次［16］。將3次提取收集的上清液旋轉蒸發至合適的體積并加入4倍體積的95%（V/V）乙醇過夜沉淀，10 000 r/min離心15 min獲得多糖，用苯酚硫酸法對獲得的優勢菌株菌絲胞內多糖進行測定。

1.2.5 優勢菌株的生物學鑒定

1.2.5.1 拮抗實驗 篩選獲得的最佳優勢菌株和出發菌株（CK）分別取0.5 cm×0.5 cm大小菌塊一起接種到PDA培養基平板上，兩菌塊距離1 cm，26℃避光培養，2周后觀察菌株之間的拮抗反應現象。

1.2.5.2 RAPD分析 用改良的CTAB法［17］提取最佳突變菌株的DNA，并對其用6條隨機引物：GGTGACGCAG（S7）、GTCCACACGG（S8）、GGAGGGTGTT（S15）、AGGGAACGAG（S17）、TTCCGAACCC（S35）、CAAACGTCGG（S39）進行RAPD多態性擴增和分析。RAPD-PCR擴增總體系為25μL，包括10×buffer（含 Mg2+）2.5μL，dNTPs 2μL，引物 0.5μL，DNA模版 1μL（100 ng），Taq酶 0.5μL，ddH2O 18.5μL；RAPD-PCR擴增條件：94℃預變性5 min；94℃變性1 min，37℃退火1 min，72℃延伸5 min，35個循環；72℃延伸10 min。PCR產物用1.2%（W/V）的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.6 優勢菌株抗氧化能力的測定

1.2.6.1 羥基自由基清除能力的測定 羥基自由基清除能力的測定參考邵曉東等［18］的方法并加以改進。用超純水配制0.1 mol/L Na2CO3溶液、0.05 mol/L Na2CO3溶液和0.05 mol/L NaHCO3溶液，稱取1.77 mg魯米諾加入10 mL 0.1 mol/L Na2CO3溶液得1 mmol/L魯米諾溶液，將0.05 mol/L NaHCO3溶液逐滴加入到0.05 mol/LNa2CO3溶液中使得混合液（碳酸鈉緩沖液CBS）的pH為8.5，配制1 mmol/L CuCl和1 mmol/L鄰菲羅啉作為反應液。配制6%H2O2溶液為微孔板發光檢測儀泵1緩沖液，碳酸鈉緩沖液CBS∶1mmol/L魯米諾溶液為17∶1的混合液作為微孔板發光檢測儀泵2緩沖液。取溶解好的粗多糖樣品10μL并加入10μL 1 mmol/L CuCl和10μL 1 mmol/L鄰菲羅啉，放置于微孔板發光檢測儀中檢測。

1.2.6.2 Trolox等價抗氧化能力的測定 Trolox等價抗氧化能力（TEAC）的測定參考Zhang等［16］的方法。以水溶性維生素E為參照物，配制7.4 mmol/L的ABTS溶液，稱取13.2 mg過硫酸鉀加入到20 mL 7.4 mmol/L的ABTS溶液中，放置暗處室溫攪拌12—16 h，產生暗藍綠色溶液，此溶液用PBS稀釋，得到在734 nm時吸光值為0.70的溶液。在4 h內測定樣品的抗氧化活性，所測樣品及Trolox預先溶于PBS緩沖液中，取100μL樣品液加入到3.90 mL已反應過的ABTS溶液中20 min后，在734 nm下測其吸光值（A）。

樣品的自由基清除能力按如下方程計算：自由基清除能力＝（1-A/A0）×100%，其中A、A0分別為溶液中存在和不存在ABTS·+自由基的吸光值。

1.2.6.3 鐵還原抗氧化離子的測定 鐵還原抗氧化能力（FRAP）的測定參考Zhang等［16］的方法。準備多糖樣品溶液100μL，與新鮮的900μL FRAP試劑在37℃下混合均勻，室溫下孵育2 h。待反應結束，設定紫外分光光度計吸收波長為593 nm，測定樣品的吸光值。根據硫酸亞鐵的標準曲線，將吸光值轉換為FRAP值。

2 結果與分析

2.1 ARTP誘變致死率的分析

ARTP照射時間不同，對菌體的致死率也不同［19］。如圖1所示：ARTP照射處理時間在0—30 s時，隨著處理時間的延長，猴頭菌原生質體的致死率快速上升，在30 s時原生質體致死率達到73.6%；照射時間繼續延長，致死率不斷上升，在40 s時原生質體致死率達到100%。因此，選擇照射處理時間為30 s，致死率為73.6%進行誘變。

圖1 猴頭菌原生質體ARTP誘變致死曲線Fig.1 ARTPmutagenic lethal curve of H.erinaceus protoplasts

2.2 ARTP誘變及優良菌株的初篩

對猴頭菌原生質體進行ARTP照射處理后，以再生速度快、菌絲致密的再生菌株為篩選對象進行傳代培養。經過5代傳代培養，獲得5株遺傳穩定且生長速度快的優勢菌株。如表1所示，5株優勢菌株每代的菌絲生長速度均大于出發菌株（CK），且每代菌絲體生長速度相對穩定。

表1 各代猴頭菌株菌絲生長速度Table 1 M ycelial grow th rate of each generation of H.erinareus

2.3 優良菌株的復篩

為了得到性狀優良、遺傳穩定、高產胞內多糖的猴頭菌株，以出發菌株作為對照，對初篩得到的5株優良菌株以搖瓶發酵生物產量能力和菌絲體胞內多糖含量為指標進行復篩。如表2所示，5株優良菌株的生物量和胞內多糖含量與對照相比，均有不同幅度的提高，且5株菌株的多糖含量均高于出發菌株10%以上。其中，菌株321的生物量提高率和多糖含量提高率最高，分別為30.37%和47.45%。

表2 ARTP誘變對猴頭菌株菌絲發酵生物量和胞內多糖含量的影響Table 2 Effects of ARTPmutagenesis on m ycelial fermentation biomass and intracellular polysaccharide content of H.erinareus

2.4 突變菌株的生物學鑒定

2.4.1 拮抗實驗

菌絲之間的拮抗反應是菌株間遺傳特性不同的重要表現，親緣關系越遠，株系間的拮抗越強［20］。如圖2所示，菌株321與出發菌株（CK）之間產生了明顯的拮抗線，表明兩菌株生長相互抑制，且菌株321與出發菌株相比有顯著的生長優勢。該結果暗示ARTP輻照猴頭菌原生質體可能使其遺傳物質發生了改變。

2.4.2 RAPD分析

RAPD分析具有時間短、效率高和靈敏度高等優點，可以在整個基因組DNA水平上分析不同菌株的親緣關系［21］。如圖3所示，菌株321與出發菌株（CK）的電泳圖譜相比較，RAPD多態性擴增結果出現了不同程度的差異，從分子水平上證實了菌株321的遺傳物質發生了改變，表明菌株321為突變新菌株。

圖2 菌株321與出發菌株（CK）的拮抗實驗Fig.2 Antagonistic experiment between original strain（CK）and strain 321

圖3 菌株321的RAPD電泳圖譜Fig.3 RAPD electrophoretogram of strain 321

2.5 ARTP輻照對猴頭菌菌絲體多糖抗氧化活性的影響

2.5.1 誘變前后猴頭菌菌絲多糖羥基自由基清除能力的比較

為了考察ARTP誘變對猴頭菌菌絲體多糖羥基自由基清除能力的影響，對菌株321菌絲體多糖和出發菌株菌絲體多糖進行了比較，結果顯示：菌株321菌絲體胞內多糖羥基自由基清除率為42.86%，出發菌株菌絲體胞內多糖羥基自由基清除率為27.72%。試驗表明，優勢菌株321菌絲體胞內多糖和出發菌株菌絲體胞內多糖對羥基自由基均有清除作用，但優勢菌株321菌絲體胞內多糖的羥基自由基清除能力強于出發菌株，提高了54.7%，表現出了更強的羥基自由基清除能力。

2.5.2 誘變前后猴頭菌絲多糖TEAC和FRAP比較

為了考察ARTP誘變對猴頭菌菌絲體多糖總抗氧化能力和Fe2+還原能力的影響，對菌株321和出發菌株的菌絲體多糖進行了比較。從圖4可以看出，出發菌株（CK）和優勢菌株321菌絲體胞內粗多糖都具有抗氧化能力，但優勢菌株321菌絲體胞內粗多糖抗氧化（TEAC和FRAP）能力均大于出發菌株。優勢菌株321對Fe2+還原及清除ABTS·+自由基的能力分別為14.75μmol Fe2+/g和132.81μmol Trolox/g，分別較出發菌株提高了19.7%和26.8%，表明優勢菌株321菌絲體胞內多糖比出發菌株具有更強的抗氧化作用。

圖4 菌株321與出發菌株（CK）的抗氧化能力Fig.4 Antioxidant ability of strain 321 and original strain（CK）

3 討論

猴頭菌具有多種顯著的藥理活性，近年來被眾多學者廣泛研究，其營養保健作用也日益被消費者所熟知，市場相關產品也越來越多，如猴菇餅干、猴菇米稀、猴菇飲料等。研究表明，猴頭菌類產品中發揮主要活性作用的是猴頭多糖［22］。因此，通過菌種選育獲得可應用于工業生產的高產多糖猴頭菌株，對進一步拓展猴頭菌資源的開發和利用是非常有意義的。常壓室溫等離子體誘變作為一種新興的誘變方法，在一定程度上較好地彌補了傳統誘變熱點鈍化的缺陷［23］。王楠等［24］利用紫外誘變猴頭菌得到一個優勢突變菌株，該菌株與出發菌株相比生物量和菌絲體多糖含量分別提高了9.00%和28.88%。本研究將ARTP應用于猴頭菌株顯示了良好的誘變效果，經篩選獲得5株性狀穩定的優良突變菌株，搖瓶發酵菌絲干重和菌絲體胞內多糖含量與對照相比均有不同程度的提高，其中菌株321的生產能力表現最佳，生物量和多糖含量分別提高了30.37%和47.45%。研究結果顯示，篩選獲得優勢突變菌株的單位菌絲干重對應的多糖含量不盡相同，暗示ARTP的作用機制可能比較復雜，推測其糖生物合成途徑可能受到了影響，糖代謝途徑也可能受到了影響。拮抗實驗和RAPD分析證實，菌株321遺傳物質發生了改變，為突變新菌株。RAPD分析結果同時暗示ARTP誘變可以導致出發菌株細胞DNA發生多位點突變。抗氧化結果顯示，突變菌株321的體外抗氧化能力和羥基自由基清除能力均優于出發菌株，表明ARTP誘變不僅可以促進猴頭菌株生產能力的提高，也可以提高菌絲體胞內多糖的抗氧化活性。綜上，ARTP是一種高效的誘變技術，本研究通過利用ARTP誘變選育獲得了高產胞內多糖猴頭菌株，為猴頭資源更好的開發和利用奠定了基礎，同時為ARTP誘變技術應用于其他擔子菌提供了依據。