培養基組分對茵芋花粉萌發和花粉管生長的影響

鄭天漢

（福建省林業局，福州350003）

茵芋（Skimmiareevesiana），又稱黃山桂，具有治療風濕痹痛、四肢攣急、兩足軟弱等藥用價值，也是觀葉、觀花、觀果俱佳植物。張琪等［1］從成分、藥理、臨床應用等方面探討了茵芋的藥用價值；鄭天漢等［2］利用電鏡手段觀測了茵芋的生物學特征；張洪杰等［3］分析了多脈茵芋（Skimmiamultinervia）的化學成分；鄭天漢等［4］開展了不同基質與激素對茵芋扦插萌芽效應的研究。由于茵芋生長在海拔1 400—2 400 m的野生環境條件下，繁殖較困難，原生種質資源稀少，因此通過人工輔助授粉方法提高茵芋的授粉、結實率具有現實意義。目前，有關培養基組分對茵芋花粉離體萌發影響的研究未見報道。本試驗對不同培養基中茵芋花粉的萌發和花粉管生長情況進行研究，分析其增殖條件，以期為茵芋人工輔助授粉、種質基因保存、異地授粉和雜交育種等提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

所用的茵芋花粉材料來自生長健壯、無病蟲害的3年生盆栽茵芋雄株，生長于福建省洋口國有林場，平均冠幅23 cm，平均株高28 cm。于2016年3月22日即茵芋盛花期采集材料。選取飽滿剛開裂但未散粉或即將開裂散粉的花藥，用鑷子夾起花藥囊，用解剖針刺破，抖落散出花粉，將花粉收集于載玻片上備用。

利用三因素（A代表蔗糖、B代表硼酸、C代表氯化鈣）三水平（分別用1、2、3表示）設置不同的培養基進行花粉萌發的離體培養試驗，試驗方案見表1。根據方案配制27個組合的培養基，放入花粉并用解剖針攪拌均勻，培養基中含0.7%（W/V）瓊脂，pH為5.8—6.0，置于載玻片上，轉入25℃恒溫暗條件下進行花粉萌發培養［7-8］，每4 h檢測一次，連續檢測24 h。

表1 花粉離體培養試驗方案Table 1 Test scheme of pollen culture in vitro g·L-1

1.2 花粉萌發情況的顯微觀察

每處理隨機選取5個載有花粉的載玻片置于IBE2000型倒置生物熒光顯示鏡下，每個視野花粉總數要大于30粒，觀測花粉管生長情況并拍照。花粉萌發標準為花粉管長度超過花粉粒直徑。在光學顯微鏡下用測微尺測量花粉管長度，統計各處理的花粉萌發率和花粉管長度。花粉萌發率＝萌發的花粉粒數/視野中花粉粒總數×100%。

2 結果與分析

2.1 不同培養基對茵芋花粉管生長的影響

各處理的茵芋花粉管總平均長度為 252.9μm。其中，A1、A2、A3處理的平均花粉管長度分別是172.2μm、302.9μm、284.4μm，B1、B2、B3處理的平均花粉管長度分別是 263.2μm、254.6μm、239.8μm，C1、C2、C3處理的平均花粉管長度分別是 279.6μm、287.4μm、192.4μm，即蔗糖處理的平均花粉管長度為253.2μm，硼酸處理的平均花粉管長度為252.5μm，氯化鈣處理的平均花粉管長度為253.1μm。A2的平均花粉管長度是A1的1.76倍，B1是B3的1.10倍，C2是C3的1.49倍，說明不同濃度的蔗糖、氯化鈣對茵芋花粉管生長影響較大，而不同濃度的硼酸影響較小。

方差分析表明，A、B、C單因素條件下的不同濃度水平對茵芋花粉管長度的影響極顯著（表2）。不同濃度蔗糖對茵芋花粉管長度效應表現為A2＞A3＞A1，說明10 g/L和15 g/L的蔗糖對花粉管生長促進效應明顯；不同濃度硼酸對茵芋花粉管長度效應表現為B1＞B2＞B3，說明花粉管長度隨硼酸濃度降低而增長；不同濃度氯化鈣對茵芋花粉管長度效應表現為C2＞C1＞C3，即0.02 g/L的氯化鈣最有利于花粉管生長，0.03 g/L的氯化鈣則最不利。

表2 花粉管生長的多因素互作效應方差分析Table 2 Variance analysis ofmulti factor interaction effects on pollen tube grow th

2.2 不同培養基與濃度水平對茵芋花粉管生長的交互效應

由圖1可知，A×B×C構成的27種培養基對茵芋花粉管長度的影響表現為A3B1C2＞A3B2C2＞A2B3C2＞A2B2C2＞A3B1C1＞A2B2C1＞A3B3C1＞A2B1C3＞A2B1C1＞A2B1C2＞A2B3C3＞A3B3C2＞A3B2C1＞A1B1C1＞A2B2C3＞A2B3C1＞A1B3C1＞A1B2C1＞A3B2C3＞A3B3C3＞A1B2C2＞A1B3C2＞A1B1C2＞A3B1C3＞A1B2C3＞A1B1C3＞A1B3C3。A3B1C2組合最有利于促進花粉管生長，其花粉管長度是最不利培養基的4.3倍，表明蔗糖、硼酸、氯化鈣及其濃度對茵芋花粉管長度具有明顯的影響。

圖1 A、B、C互作效應的花粉管長度Fig.1 Pollen tube length of A，B，C interaction effect

由表2可知，A×B×C對茵芋花粉管長度的互作效應差異顯著，A×C互作效應差異極顯著，A×B和B×C的互作效應差異不顯著。為進一步分析各因素及其濃度水平的互作效應來源，分別對蔗糖、硼酸、氯化鈣三因素三水平組合進行分組分析。

由圖2可知，A1、A2、A3分別與B構成的3個組合，各組內的花粉管長度基本一致，結合上述蔗糖單因素分析結果A2＞A3＞A1，說明組間的花粉管長度差異是來源于不同的蔗糖濃度，由此可以認為B因素及其濃度對花粉管長度基本沒有影響。

由圖3可知，A1、A2、A3分別與C構成的3個組合，在組內和組間都有明顯效應，結合上述氯化鈣單因素分析結果C2＞C1＞C3，說明A×C具有明顯組合效應，其中A2C2和A3C2對茵芋花粉管生長的促進作用最明顯。

圖2 A、B互作的花粉管長度Fig.2 Pollen tube length of A，B interaction

圖3 A、C互作的花粉管長度Fig.3 Pollen tube length of A，C interaction

由圖4可知，B×C構成的組合，在組內由C3即較高濃度的氯化鈣引發差異，但在組間差異小，結合上述氯化鈣單因素分析結果B1＞B2＞B3，說明B×C組合對茵芋花粉管生長沒有實際意義。同時，由圖3和圖4可見，C3即較高濃度的氯化鈣對茵芋花粉管生長具有抑制作用。

圖4 B、C互作的花粉管長度Fig.4 Pollen tube length of B，C interaction

2.3 不同培養基對茵芋花粉萌發率的影響

各處理組中，A1、A2、A3處理的平均萌發率分別是33.3%、41.1%、41.9%，B1、B2、B3處理的平均萌發率分別是34.4%、40.8%、41.2%，C1、C2、C3處理的平均萌發率分別是38.4%、45.6%、32.4%。試驗所采用的3種蔗糖濃度對茵芋花粉萌發率效應表現為A3＞A2＞A1，即茵芋花粉萌發率隨著蔗糖濃度增加而提高，而且A3、A2的萌發率分別比A1高25.8%、23.4%，A3的萌發率僅比A2高2.0%，說明5 g/L蔗糖偏低，10 g/L蔗糖可作為培養基合理濃度。試驗所采用的3種氯化鈣濃度對茵芋花粉萌發率效應表現為C2＞C1＞C3，即0.02 g/L氯化鈣促進茵芋花粉萌發作用最好，0.03 g/L氯化鈣則抑制了茵芋花粉萌發。前人研究表明［10］，細胞中98%的硼主要位于細胞壁，以酯化果膠形式存在，而在花粉管中，酯化果膠集中在花粉管頂端，使頂端存在一定的延展性以利于延伸生長，而酸性果膠遍及整個花粉管，使細胞壁有足夠的機械強度。一般情況下，花粉中硼是不足的，植物在自然授粉時由雌花柱頭和花柱內的硼補償，在花粉離體狀態下，適宜濃度的硼處理能有效提高花粉的萌芽率。試驗所采用的3種硼酸濃度對茵芋花粉萌發率效應表現為B3＞B2＞B1，即茵芋花粉萌發率隨著硼酸濃度的增加而提高，B3、B2的萌發率分別比B1高20.0%、18.6%，B3比B2高1.0%，說明0.01 g/L硼酸偏低，0.03 g/L硼酸可作為培養基合理濃度。

2.4 不同培養基組合下茵芋花粉萌發率、花粉管長度的相關分析

A×B組合與A×C組合的茵芋花粉萌發率相關系數為0.1834，差異不顯著；A×B組合與B×C組合的萌發率相關系數為0.7599，差異顯著；A×C組合與B×C組合的萌發率相關系數為0.2239，差異不顯著。相關分析結果說明，3種組合類型對茵芋花粉萌發率的影響具有一致性，結合上述的萌發率效應比較，表明3種組合均對茵芋花粉萌發有促進作用。

A×B組合與A×C組合的茵芋花粉管長度相關系數為0.8081，差異顯著；A×B組合與B×C組合的花粉管長度相關系數為-0.0219，差異不顯著；A×C組合與B×C組合的花粉管長度相關系數為0.4076，差異不顯著。相關分析表明，A×B組合與A×C組合對茵芋花粉管生長差異顯著，其他兩種組合則不具一致性。

萌發率與花粉管長度在A×B×C三因素構成的27個組合的測定值相關系數為0.5812，具有顯著水平，說明蔗糖、硼酸、氯化鈣三因素三水平交互作用在茵芋花粉萌發率和花粉管長度之間具有較高的一致性。觀察花粉管生長過程，發現花粉管生長具有明顯趨向培養基營養液的效應，說明蔗糖、硼酸、氯化鈣對茵芋花粉萌發和花粉管生長兩方面都發揮了作用。

由表3可見，A×B的萌發率與A×B、A×C、B×C的花粉管長度之間的相關系數分別為0.6659、0.9979、0.9987，呈正相關；其中，A×B的萌發率與A×B的花粉管長度的相關性不顯著，A×B的萌發率與A×C、B×C的花粉管長度的相關性表現為極顯著正相關；說明A×B的萌發率與A×B、A×C、B×C的花粉管生長都具有一致性，其中A×B的萌發率與A×C、B×C的花粉管生長具有極顯著共同趨向。A×C的萌發率與A×B、A×C、B×C的花粉管長度的相關系數分別為0.3812、-0.3911、-0.1238，二者之間均表現為不顯著的正相關或負相關。B×C的萌發率與A×B、A×C、B×C的花粉管長度之間表現為不顯著的負相關。說明不同組合之間對茵芋花粉萌發率和花粉管生長的影響均具有不一致的效應，負相關說明有利于花粉萌發卻抑制花粉管生長，反之亦然。

表3 萌發率與花粉管長度在組合間的相關分析Table 3 Correlation analysis between germ ination rate and pollen tube length in combination

3 結論

本試驗表明，不同濃度的蔗糖、硼酸、氯化鈣對茵芋花粉管長度有顯著影響。具體為各因素在水平之間差異明顯，其中不同濃度的蔗糖、氯化鈣對茵芋花粉管生長影響較大，不同濃度的硼酸影響較小；三因素及其水平之間的交互效應明顯，A3B1C2組合的花粉管最長（398.8μm），A3B2C2組合次之（364.4μm）；最優培養基A3B1C2的花粉管長度是最差培養基A1B3C3（92.8μm）的4.3倍，是最優單因素培養基（A2）花粉管長度的1.32倍，是最優雙因素培養基（A3C2）花粉管長度的1.14倍，表明蔗糖、硼酸、氯化鈣三因素組合對茵芋花粉管長度的影響十分明顯。綜合分析培養基組分對茵芋花粉管生長影響的主次作用，表現為氯化鈣發揮主因素作用，硼酸發揮次因素作用，蔗糖發揮輔助作用。

蔗糖、硼酸、氯化鈣三因素三水平互作下，對茵芋花粉萌發率和花粉管生長的影響效應具有較強一致性，蔗糖、硼酸、氯化鈣對于茵芋花粉萌發和花粉管生長兩方面都發揮了作用。A×B、A×C、B×C的雙因素組合中，對茵芋花粉萌發率的影響具有一致性，對茵芋花粉管生長的影響則不具一致性。

致謝：阮偉倫院士對茵芋課題研究技術方案給予指導，何國生教授、黃青山高工、華偉平講師參與茵芋野外種質調查與材料提取，阮淑明副教授參與茵芋花粉萌發試驗，特此感謝！