夏季不同時期浮床植物旱傘草和美人蕉對銅綠微囊藻的化感作用研究

潘 琦，劉婭琴，鄒國燕，周文宗，付子軾，劉長娥，宋祥甫

（上海市農(nóng)業(yè)科學院，上海201403）

日益加劇的水體富營養(yǎng)化促使水域中的藻類大量繁殖，而藻類失控的暴發(fā)性生長會引發(fā)水華的形成，大量消耗水體中的溶解氧，其直接后果便是造成水生動物的窒息死亡，給水產(chǎn)養(yǎng)殖帶來不可估量的損失。藻類產(chǎn)生的藻毒素，其危害不僅僅是引起動物的中毒，還可以通過食物鏈威脅人類的健康，甚至引發(fā)生態(tài)系統(tǒng)失衡，因此水環(huán)境的污染已經(jīng)成為當今人類亟待解決的嚴峻問題［1］。生態(tài)浮床利用水上種植技術，通過陸生植物根系的吸附和吸收作用，富集水中氮、磷等元素，降解和富集其他有害有毒污染物，并以收獲植物體的形式將其搬離水體，從而實現(xiàn)凈化水體、保護水生態(tài)環(huán)境的目的。實踐證明，生態(tài)浮床技術在治理富營養(yǎng)化水體方面效果顯著［2-4］。

國內(nèi)外利用植物化感物質(zhì)抑制藻類的研究比較多，但多集中在水生植物對藻類的化感作用上［5-9］，大型陸生植物對藻類化感作用的研究較少。本研究利用生態(tài)浮床技術，以生長速度快、凈化水質(zhì)能力強的陸生植物美人蕉和旱傘草為供試植物，在其生長最為旺盛，同時也是水華最易暴發(fā)的6—8月進行試驗，研究夏季不同生長時期兩種美人蕉和旱傘草生長及其對藍藻水華的主要組成者銅綠微囊藻的影響，并利用GC-MS分析其根系分泌的化學物質(zhì)，為進一步探討陸生植物對藻類的抑制機理奠定基礎。

1 材料方法

1.1 試驗材料

1.1.1 植物材料

旱傘草（CyperusalternifoliusL.）、美人蕉（CannaindicaL.）、黃花美人蕉（C.indicaL.var.flavaRoxb.）培育于上海市陸家浜河道，試驗前洗凈植物根系，將其移植到大棚水泥池，采用Hoagland營養(yǎng)液培養(yǎng)1 d。

1.1.2 銅綠微囊藻

銅綠微囊藻（Microcystisaeruginosa）由中國科學院水生生物研究所淡水藻種庫提供，藻類試驗起始濃度約為2×105個/mL。

1.2 試驗方法

1.2.1 植物種植水的制作

根據(jù)浮床植物美人蕉等的生長特點及其對水體氮磷吸收的最佳時間段［10-11］，在溫室大棚內(nèi)進行植物種植水的制作。6月15日開始挑選大小和重量基本一致的旱傘草、美人蕉、黃花美人蕉，種植于大棚內(nèi)的水泥池。分4期（6月15日，7月3日，7月21日，8月10日）從每種植物中各取兩株，將其根系用蒸餾水洗凈，單株種植在盛有8 L 1/20 Hoagland營養(yǎng)液的塑料桶中培養(yǎng)，供后續(xù)試驗用。每期各品種設2個重復，定期補充蒸餾水以消除植物蒸騰和水分蒸發(fā)對試驗效果的影響。植株在塑料桶中培養(yǎng)72 h，收集該植物的種植水，進行根系分泌物的抑藻試驗。考慮到后續(xù)三期植物根系生長迅速，根系分泌物質(zhì)產(chǎn)生也較多，所以以第一期取樣時植物的根/水濃度比例［根系重量（g）/種植水體積（L）］作為旱傘草和美人蕉的標準根系單位濃度，對余下三期水樣進行稀釋，使4期最終的種植水根系單位濃度一致，便于在同等條件下，對各期種植水的抑藻效果進行比較。取樣完畢后，將每株植物的根系和地上部放置于烘箱內(nèi)，70°條件下烘干至恒重，冷卻后分別稱量干物重。

1.2.2 植物種植水抑藻效果試驗

取種植水1 L，用WATERMAN濾膜（孔徑0.90μm）抽濾后，濾液加CB培養(yǎng)液100mL，在超凈工作臺上抽濾滅菌后，量取10 mL，倒入滅過菌的三角錐形瓶中，每種植物種植水設3次重復，空白對照僅添加10 mL CB培養(yǎng)液。

向各處理中添加100μL銅綠微囊藻，置于培養(yǎng)箱中，溫度為25℃，光照強度為3 000 lx，光暗比為12 h∶12 h，80 r/min震蕩培養(yǎng)，每5 d用血球計數(shù)板記錄藻類數(shù)量。同時，采用分光光度法［12］測定銅綠微囊藻葉綠素a的含量。種植水對藻類的抑制率（RI）：RI＝（1-N/N0）×100%。式中：N為種植水組藻密度；N0為對照組藻密度。

1.2.3 根系分泌物的收集濃縮

種植水經(jīng)濾膜抽濾后，濾液用濃鹽酸調(diào)節(jié)至pH 1.5，取150 mL進行固相萃取。

使用Oasis HLB固相萃取柱，先用4 m甲醇活化柱子，再用4mL pH 1.5鹽酸清洗，種植水以3 mL/min的速度過柱后，用4 mL pH 1.5鹽酸洗柱。待水完全抽干后，用20 mL甲醇洗脫柱子上的提取物。無水硫酸鈉處理脫水，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至5 mL。

1.2.4 GC-MS處理分析

取濃縮后的根系分泌物2 mL，45℃下氮氣吹干，加入100μL BSTFA和200μL正己烷，封管，120℃反應30 min，取1.0μL反應液進行GC-MS分析。

GC-MS測定的條件為：檢測儀器Finnigan Voyager氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，色譜柱VF-5 ms，石英毛細管柱30 m×0.25 mm；柱溫80℃（保持2 min），以20℃/min的速率升至300℃（保持10 min），汽化溫度250℃；載氣流量 He（1.0 mL/min）；分流比20∶1；進樣量1.0μL；質(zhì)譜檢測器：EI源，電子能量70 eV，源溫200℃。植物根系分泌物的定性根據(jù)質(zhì)譜圖與Wiley 7.0標準質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫對照［13］。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 9.0軟件進行數(shù)據(jù)處理與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 旱傘草和兩種美人蕉植物生長情況的比較

如表1所示，第四期（8月10日）旱傘草、美人蕉和黃花美人蕉生物量干重分別是第一期（6月15日）6.9倍、4.6倍和5.3倍，根系分別為7.5倍、2.5倍和3.0倍。通過吸收水體氮磷，旱傘草和兩個品種的美人蕉生物量增加顯著。其中，旱傘草生長迅速，生物量變化最大，黃花美人蕉其次，美人蕉最小。

表1 不同取樣時期各植物的生物量Table 1 Biomass of plants in each period

2.2 旱傘草和兩種美人蕉種植水對藻類生長的影響

圖1顯示，旱傘草和美人蕉各期種植水對銅綠微囊藻生長均有一定的抑制效果，說明旱傘草和美人蕉根系分泌了某些抑制銅綠微囊藻生長的物質(zhì)。第一期3種植物種植水對銅綠微囊藻的抑制作用較好，隨著培養(yǎng)時間的延續(xù)，種植水中藻類數(shù)量增加緩慢，旱傘草和兩種美人蕉種植水對銅綠微囊藻的抑制效果差異不顯著。但在其后的第二、三、四期培養(yǎng)過程中，可以明顯看出旱傘草的抑藻效果弱于美人蕉，兩種美人蕉對銅綠微囊藻的抑藻效果差異較小。第四期藻類共培養(yǎng)試驗中，旱傘草種植水對銅綠微囊藻的生長抑制效果已十分微弱，美人蕉和黃花美人蕉則仍保持一定的抑藻效果。整個試驗期間旱傘草生物量及根系生長最迅速，其種植水抑藻效果卻低于美人蕉，美人蕉和黃花美人蕉生物量和根系生長雖有差異，但兩種植物種植水對藻類抑藻效果差異不顯著。可見植物種類不同，營養(yǎng)生長階段其根系分泌物的抑藻效果也有差異。

圖1 銅綠微囊藻在3種植物種植水中培養(yǎng)20 d生長曲線變化Fig.1 The grow th curves of M icrocystis aeruginosa w ith the roots exudates of three p lants in 20 days

葉綠素a是反映藻類能否正常生長及光合作用的重要指標之一。本試驗中，對照組銅綠微囊藻的葉綠素a含量分別是旱傘草、美人蕉和黃花美人蕉種植水的1.47倍、1.98倍和2.53倍，差異顯著（P＜0.05）。由此推測，3種植物種植水是通過破壞藻類葉綠素a的合成來影響銅綠微囊藻正常生長的。

2.3 植物不同生長時期3種植物種植水對藻類生長的影響

從圖2可以看出，第一期旱傘草種植水對銅綠微囊藻的化感作用最好，其抑制率最高達到了56.3%，并且種植水培養(yǎng)藻類時間越長，抑藻效果越明顯。兩種美人蕉種植水相比，其對藻類的抑制效果無顯著差異，抑制率均在培養(yǎng)10—15 d達到最大值，第一期的抑制率最高，美人蕉達到了64.2%，黃花美人蕉為67.7%。上述結(jié)果表明，相同的單位根系濃度下，開始時，旱傘草根系產(chǎn)生和釋放的對銅綠微囊藻具有抑制作用的化感物質(zhì)成分或含量相對較高，進入生長旺季，旱傘草植株質(zhì)量增加，根系分泌物的化感物質(zhì)成分或含量相對減少。而兩種美人蕉植株生物量增加，根系分泌物對銅綠微囊藻的化感作用則無顯著變化。綜上，旱傘草植株生物量增加，其根系種植水對銅綠微囊藻的化感作用顯著降低，而美人蕉生長各期其種植水的化感作用無顯著變化。

圖2 不同生長時間旱傘草和兩種美人蕉抑藻效果比較Fig.2 Inhibit ratios of the roots exudates of three plants on the algal grow th of M icrocystis aeruginosa

2.4 GC-MS測定分析

本研究以第一期旱傘草和美人蕉種植水中提取的根系分泌物為代表，用GC-MS對分泌物的化學成分進行分析。結(jié)果表明，旱傘草根系分泌物檢測出11種化合物，美人蕉檢測出10種化合物（表2），兩種植物分泌物的化學成分多為脂肪酸和醇類化合物。與空白對照相比，3種植物的種植水中藻類葉綠素a含量下降顯著。由此推測，種植水對銅綠微囊藻的抑制作用，也是通過植物根系分泌的化合物破壞藻類葉綠素的合成來實現(xiàn)的。

表2 GC-MS分析檢測旱傘草和美人蕉根系分泌物中所得化學物質(zhì)Table 2 Compounds of roots exudates Cyperus alternifolius and Canna indica tested by GC-MS

3 討論

本試驗通過收集植物種植水獲得根系分泌物，并用無菌種植水添加藻種的方式進行培養(yǎng)，避免了植物與藻類共培養(yǎng)而引發(fā)的光照競爭、營養(yǎng)競爭及微生物干擾等因素，確保試驗中銅綠微囊藻生長變化只受植物根系分泌物影響。

化感物質(zhì)通過破壞藻類葉綠素、減少其同化產(chǎn)物的方式抑制藻類生長，如粉綠狐尾藻可破壞胞藻的葉綠素a和藻膽蛋白的特征吸收峰，降低藻細胞對光的吸收能力［14］。水生植物可以通過減少藻類細胞葉綠素含量、降低光合速率、嚴重損傷藻類類囊體反應來抑制藻類光合作用，如鳳眼蓮根系分泌物可使柵藻葉綠體解體，黑藻與銅綠微囊藻共培養(yǎng)時，微囊藻細胞葉綠素a含量顯著低于對照［15-16］。本試驗中美人蕉和旱傘草種植水也對葉綠體a有較大的抑制作用，與鳳眼蓮、黑藻對銅綠微囊藻生長的抑制效果一致。另有研究認為，植物化感物質(zhì)對藻類的抑制作用主要體現(xiàn)在影響藻類光合作用、酶活性、細胞亞顯微結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)合成，改變核酸代謝以及破壞細胞膜等［17］。浮床美人蕉和旱傘草對藻類在生理生化方面的影響，還有待做進一步深入的研究。

旱傘草和美人蕉種植水中都含有的棕櫚酸對小球藻和和斜生柵藻具有很好的抑制作用。戴樹桂等［18］研究表明，棕櫚酸對藻類的半抑制劑量為 8.2 mg/mL。Nakai等［19］從穗花狐尾藻（Myriophyllum spicatum）浸提液中，分離得到了包括棕櫚酸和硬脂酸在內(nèi)的多種脂肪酸類物質(zhì)，棕櫚酸等物質(zhì)對銅綠微囊藻具有抑制作用。張庭廷等［20］研究發(fā)現(xiàn)己酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸等脂肪酸對銅綠微囊藻、蛋白核小球藻及斜生柵藻均有抑制作用，乳酸、十五酸等也被證實具有抑藻活性［21-22］。倪利曉等［23］也認為多種脂肪酸組合具有協(xié)同抑藻作用。陳國元等［24］發(fā)現(xiàn)黃菖蒲有機酸組份的存在影響藻類正常的光合作用。

水生植物如穗狀狐尾藻和蘆葦均對銅綠微囊藻具有化感作用，但穗狀狐尾藻產(chǎn)生的化感物質(zhì)為鞣花酸、五倍子酸和焦棓酸等［25］，蘆葦中起化感作用的物質(zhì)是2-甲基乙酰乙酸乙酯（EMA），兩種植物起化感作用的成分不同［26］。本試驗檢測出的兩種植物大部分化合物相同，與前人研究結(jié)果不一致。由此推測，不同植物種類特別是陸生植物與水生植物的分泌物不同。本試驗中，美人蕉和旱傘草分泌相同或相似的化合物，這可能是受環(huán)境影響，也有可能是均屬陸生植物所致。但由于植物種類不同，其根系分泌物也存在一定的差別，因此，種植水抑制銅綠微囊藻化感效果存在一定的差異。

與第一期比較，最后一期總生物量和根系生物量均成倍的增加。6—8月份是浮床美人蕉和旱傘草旺盛生長階段，也是水華發(fā)生盛期［27-29］，將陸生植物通過生態(tài)浮床的方式種植于富營養(yǎng)化水體中，既能吸收利用水體中多余的氮磷營養(yǎng)元素，達到凈化水質(zhì)的目的，同時，植物根系分泌的化感物質(zhì)也可有效抑制藻類的繁衍和水華的暴發(fā)。本試驗條件下，單位根系濃度美人蕉的抑藻效果比旱傘草顯著，但旱傘草生物量增長高于美人蕉。因此，在將浮床植物應用于富營養(yǎng)化水體控制時，需根據(jù)不同需求來選擇植物種類和品種。本研究后續(xù)將開展檢出的未知毒性化合物對藻類的抑制效果以及相關生理生化研究。

4 結(jié)論

1.旱傘草和美人蕉、黃花美人蕉種植水對銅綠微囊藻的生長有較好抑制作用，其抑制率最高分別達到56.3%，64.2%和67.7%。第一期試驗中對照組銅綠微囊藻葉綠素a含量分別是旱傘草、美人蕉和黃花美人蕉種植水的1.47倍、1.98倍和2.53倍。

2.試驗第四期（8月10日）旱傘草、美人蕉和黃花美人蕉干物重分別是第一期（6月15日）的6.9倍、4.6倍和5.3倍，根系分別為7.5倍、2.5倍和3.0倍。隨著供試植物質(zhì)量的增加，在相同單位根系濃度種植水中，旱傘草對銅綠微囊藻的化感作用逐漸減弱，美人蕉則持續(xù)保持較好的抑制效果，兩種美人蕉間對藻類的抑制效果差異不顯著。

3.用GC-MS對旱傘草和美人蕉種植水提取物進行分析，旱傘草根系分泌物中含有棕櫚酸等11種化合物，美人蕉根系分泌物中有棕櫚酸和硬脂酸等10種化合物。

致謝：感謝日本廣島大學大學中井智司（Nakai Satoshi）教授為本試驗提供的技術支持和幫助。