葛仙米水溶性多糖含量測(cè)定方法的研究

蘇攀峰，陳 盛，許劍鋒，周 帥，劉艷芳，趙 明，王玉蘭，唐慶九*

（1上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海201306；2上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，上海201106；

3上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海201306；4湖南炎帝生物工程有限公司，株洲412000）

葛仙米是低等單細(xì)胞的藍(lán)藻，又稱珍珠菜，與地木耳（N.commune）、發(fā)菜（N.flagelliforme）同屬藍(lán)藻門（Cyanophyta）藍(lán)藻綱（Cyanophyceae）段殖藻目（Hormogonales）念珠藻科（Nostocaceae）念珠藻屬（Nostoc），有1 500多年的食用歷史［1-3］。Yang等［4］研究發(fā)現(xiàn)，食用葛仙米不含藍(lán)藻毒素，是一種有較高藥用和食用價(jià)值的經(jīng)濟(jì)藍(lán)藻。葛仙米不僅富含蛋白質(zhì)，還含有豐富的多糖［5-6］。研究表明，葛仙米多糖在提高免疫、抗腫瘤、抗凝血、抗菌性、抗氧化等方面具有重要的作用［7-11］，因此被廣泛用于食品、保健品和化妝品中。

多糖含量測(cè)定方法主要有蒽酮比色法和苯酚-硫酸法［12-14］，已經(jīng)廣泛用于植物、真菌等多糖的測(cè)定。葛仙米中多糖含量高，而且黏度非常大，多糖較難完全提取出來，運(yùn)用藥典或農(nóng)業(yè)部的多糖含量測(cè)定方法時(shí)，結(jié)果不穩(wěn)定。因此，本試驗(yàn)對(duì)葛仙米水溶性多糖提取的影響因素進(jìn)行系統(tǒng)研究，并對(duì)前處理方法的各指標(biāo)進(jìn)行考察，以期為葛仙米水溶性多糖的準(zhǔn)確測(cè)定建立基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與主要試劑

葛仙米由湖南炎帝生物工程有限公司提供，干燥粉碎后備用。重蒸酚、濃硫酸、葡萄糖均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)。

1.1.2 主要儀器

Eppendorf AG 22331高速離心機(jī)、Eppendorf移液槍（Eppendorf公司）；XW-80A漩渦振蕩器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；HWS12型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；DJ-10A傾倒式粉粹機(jī)（上海淀久中藥機(jī)械制造有限公司）；FA2004N分析天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）；ICS2500離子色譜儀（Dionex公司）；Synergy HT酶標(biāo)儀（Bio-TEK公司）；Dionex ICS2500系統(tǒng)，包括：GS50四元梯度泵、ED50A電化學(xué)檢測(cè)器（金電極）、LC30柱溫箱（30℃）；Chromeleon 6.5色譜工作站；CarboPac MA-1陰離子交換分析柱（4 mm×250 mm）（Dionex公司，美國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1 葛仙米中單糖、二糖含量測(cè)定

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［15-18］，以赤蘚糖醇、阿拉伯糖醇、海藻糖、甘露醇和葡萄糖為標(biāo)品，精確取100.0 mg的葛仙米，用超純水溶解至10 mL，室溫振蕩2 h，離心，離子色譜測(cè)單糖、二糖的含量。

色譜條件：流動(dòng)相為0.48 mol/L NaOH，0.4 m l/min的流速，柱溫30℃，上樣量25μL。

1.2.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

精確量取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL置于20 mL干燥試管中，用蒸餾水補(bǔ)至1.0 mL，分別加入5%的苯酚溶液0.5 mL、混勻后迅速加入2.5 mL濃硫酸，漩渦振蕩，沸水浴15 min，迅速冷卻至室溫，490 nm處測(cè)其吸光度，計(jì)算回歸方程，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 葛仙米水溶性多糖含量測(cè)定

其中，W是多糖質(zhì)量體積比（mg/mL），D為提取液總體積（mL），M為樣品質(zhì)量（mg）。

1.2.4 葛仙米水溶性多糖提取條件的單因素試驗(yàn)

1.2.4.1 浸泡時(shí)間對(duì)提取葛仙米水溶性多糖含量的影響

準(zhǔn)確取葛仙米100.0 mg置于具塞三角瓶中，按料液比（W/V，mg/mL）1∶500加入蒸餾水，分別在室溫下浸泡 1 h、2 h、3 h，100℃加熱提取2 h，迅速冷卻至室溫，離心（13 000 r/min、5 min），取上清測(cè)定多糖含量，重復(fù)3次，取平均值。

1.2.4.2 加熱溫度對(duì)提取葛仙米水溶性多糖含量的影響

準(zhǔn)確稱取葛仙米100.0 mg，提取溫度分別為40℃、60℃、80℃、100℃，其他提取條件同上。

1.2.4.3 加熱時(shí)間對(duì)提取葛仙米水溶性多糖含量的影響

準(zhǔn)確稱取葛仙米100.0 mg，提取時(shí)間分別為0.5 h、1 h、3 h、5 h，其他提取條件同上。

1.2.4.4 料液比對(duì)提取葛仙米水溶性多糖含量的影響

準(zhǔn)確稱取葛仙米各 100.0 mg，料液比（W/V，mg/mL）為 1∶100、1∶200、1∶500、1∶1 000，其他提取條件同上。

1.2.5 葛仙米水溶性多糖提取條件的正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取料液比、提取時(shí)間、提取溫度進(jìn)行3因素3水平［L9（33）］正交試驗(yàn)（表1）。正交試驗(yàn)的驗(yàn)證按照所確定的最優(yōu)提取工藝進(jìn)行，按‘1.2.3’的方法計(jì)算多糖含量。

表1 正交試驗(yàn)因素水平Table1 Factors and levels of orthogonal test

1.2.6 方法學(xué)考察

1.2.6.1 溶液制備

準(zhǔn)確稱取葛仙米100.0 mg置于具塞三角瓶中，采用最優(yōu)條件進(jìn)行提取，離心、取上清液稀釋10倍作為待測(cè)溶液。

1.2.6.2 精密度考察

取待測(cè)溶液重復(fù)測(cè)定6次，計(jì)算出多糖的含量和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

1.2.6.3 重現(xiàn)性考察

取葛仙米多糖樣品6份，測(cè)定、計(jì)算出多糖的含量和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

1.2.6.4 穩(wěn)定性考察

取待測(cè)溶液，每隔1 min測(cè)定1次，連續(xù)記錄60 min考察穩(wěn)定性，計(jì)算出多糖的含量和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

1.2.6.5 加樣回收率考察

精密移取待測(cè)多糖溶液6份，按樣品含量與葡萄糖對(duì)照品含量比例（1∶1）加入對(duì)照品，計(jì)算出多糖的含量和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），計(jì)算加樣回收率。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)分析

采用Stata軟件進(jìn)行方差分析，P≤0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 葛仙米中多糖含量測(cè)定的干擾物質(zhì)分析

對(duì)葛仙米水提物中的單糖、二糖進(jìn)行分析，并與標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比對(duì)和定量（圖1），結(jié)果發(fā)現(xiàn)：葛仙米中可溶性的單糖和二糖均含量極低，其中赤蘚糖醇、海藻糖和葡萄糖的含量分別為0.04%、0.07%、0.008%，而葛仙米原料中水溶性多糖含量在30%左右。

2.2 葛仙米水溶性多糖提取條件的單因素結(jié)果分析

未浸泡的葛仙米水溶性多糖的含量最低，浸泡3 h的葛仙米多糖的含量最高，但浸泡時(shí)間對(duì)多糖溶出無顯著性影響（圖2a）。隨著溫度的升高，多糖含量顯著增加，100℃時(shí)多糖溶出度最高，且各溫度處理間差異顯著（圖2b）。加熱時(shí)間是影響多糖從胞內(nèi)溶出的一個(gè)重要因素，隨著加熱時(shí)間的增加，多糖含量逐漸升高。當(dāng)加熱時(shí)間為5 h時(shí)，葛仙米水溶性多糖的含量最高，且各處理間差異顯著，說明溫度對(duì)提取葛仙米水溶性多糖含量的影響較大（圖2c）。當(dāng)料液比在1∶200—1∶500時(shí)，多糖含量隨著料液比的增加而提高；料液比為1∶1 000時(shí)，葛仙米水溶性多糖的含量下降（圖2d），原因可能是提取溶劑的增加改變了細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓，不利于多糖的溶出，因此選擇料液比1∶500。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品（a）與葛仙米中（b）的單糖和二糖離子色譜圖Fig.1 Chromatograms of Monosaccharide and disaccharide of standard（a）and Nostoc sphaeroides kutz（b）

圖2 提取條件對(duì)葛仙米水溶性多糖含量的影響Fig.2 Effect of extraction conditions on extraction content of Nostoc Sphaeroides kutz water-soluble polysaccharide

2.3 葛仙米水溶性多糖正交試驗(yàn)分析

從表2中的極差值大小可以看出，RA＞RB＞RC，影響因素的順序?yàn)闇囟龋緯r(shí)間＞料液比。由均值大小可知，最優(yōu)試驗(yàn)方案為：溫度100℃、時(shí)間6 h、料液比為1∶1 000。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果（n=9）Table 2 Results of orthogonal experiments

對(duì)正交試驗(yàn)獲得的最佳條件進(jìn)行驗(yàn)證，料液比為1∶1 000和1∶500時(shí)，多糖的含量分別為32.98%和32.65%。由于兩者無顯著差異，為了節(jié)省成本，選擇料液比為1∶500。

2.4 方法學(xué)考察結(jié)果

2.4.1 線性考察

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線可知，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度（y）與吸光度值（x）的線性回歸方程y＝0.1202x-0.0054，R2＝0.9997，表明葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度在0—0.1 mg/mL時(shí)，與吸光度值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 The standard curve

2.4.2 精密度、重現(xiàn)性、顯色穩(wěn)定性考察

由表3可見，苯酚-硫酸法測(cè)定葛仙米水溶性多糖的結(jié)果精密度高、重現(xiàn)性好及顯色反應(yīng)的穩(wěn)定性良好，試驗(yàn)數(shù)據(jù)可靠。

表3 精密度、重現(xiàn)性、顯色穩(wěn)定性的考察結(jié)果Table 3 Results of Precision，reproducibility and color stability

2.4.3 加樣回收率考察

如表4所示，較小的RSD值顯示試驗(yàn)數(shù)據(jù)的可信度較大；加樣回收率均值為100.13%，表明加樣回收率高，測(cè)定值能夠反應(yīng)實(shí)際值。

表4 加樣回收率結(jié)果（n=6）Table 4 Results of recovery rate experiment

3 結(jié)論與討論

通過單因素和正交試驗(yàn)對(duì)葛仙米水溶性多糖測(cè)定的前處理?xiàng)l件進(jìn)行優(yōu)化，獲得了最佳提取條件為溫度100℃、時(shí)間6 h、料液比1∶500，運(yùn)用優(yōu)化的提取條件，用苯酚硫酸法測(cè)定發(fā)現(xiàn)葛仙米中多糖含量為32.65%，該方法穩(wěn)定性好，精密度高，重現(xiàn)性好，適合葛仙米中多糖含量的測(cè)定。

葛仙米原料中多糖含量高、黏度大［19-21］，運(yùn)用常用的原料預(yù)處理方法不能將其中的多糖充分提取出來，通過單因素和正交試驗(yàn)的優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)其合適的料液比為1∶500，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于一般的多糖提取中使用的1∶50—1∶100，同時(shí)提取時(shí)間需要到6 h，也比一般的多糖提取時(shí)間1—2 h長(zhǎng)［22-24］。通過對(duì)提取方法的優(yōu)化，葛仙米中水溶性多糖含量測(cè)定穩(wěn)定，為葛仙米多糖產(chǎn)品的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

一般多糖的測(cè)定大多需要用水提醇沉去除單糖和寡糖等成分的干擾，或采用多糖減去寡糖的方法。通過陰離子色譜檢測(cè)發(fā)現(xiàn)葛仙米水提物中干擾物質(zhì)影響較小，所以在多糖含量測(cè)定時(shí)前處理中不需要進(jìn)行乙醇沉淀去除干擾物質(zhì)，可直接用水提物進(jìn)行分析。