煙草miRNA169 基因家族及啟動子的生物信息學分析

蔡健宇，賈蒙驁，張孝廉，3，余 婧，李 勇，雷 波，郭玉雙*

1.貴州省煙草科學研究院 煙草行業分子遺傳重點實驗室，貴陽市觀山湖區龍潭壩路29 號 550081

2.浙江省寧波市寧海縣農業農村局，浙江省寧波市寧海縣桃源中路118 號 315600

3.貴州大學生命科學學院，貴陽市花溪區花溪大道南段2708 號 550025

4.東北農業大學生命科學學院，哈爾濱市香坊區木材街59 號 150030

煙草早花使煙株提前進入生殖生長期，導致煙葉產量和品質明顯下降，造成巨大經濟損失［1］。引起煙草早花的因素復雜多樣，其中溫度是最主要的影響因素之一［2］。低溫脅迫可以改變作物的花期，從而影響作物產量和品質［3］。在中國南部煙區，低溫、脅迫誘導的煙草早花現象嚴重影響了煙葉生產和農民增收［4］。目前生產上主要采取加強田間管理、地膜覆蓋和打頂等補救措施來抑制煙草早花［5］，而真正解決低溫脅迫誘導早花的根本途徑則是明確低溫脅迫誘導煙草早花的分子機制，培育出耐低溫、抗早花的煙草新品種。然而目前對植物早花相關分子機制的研究主要集中在擬南芥（Arabidopsis thaliana）上［6］，低溫脅迫誘導煙草早花的分子機制仍不明確。

microRNA，簡稱miRNA，是一類長度約為22個核苷酸（nucleotide，nt）的內源單鏈非編碼小分子RNA[7]。2002 年首次從模式植物擬南芥中發現miRNA，揭 開 了 植 物miRNA 研 究 的 序 幕［8］。miRNA 等調控小分子RNA 這一發現，使人們對RNA 調控基因表達的功能有了全新認識。這類調控小分子RNA 在植物生長素信號、葉片發育、花器官形成等生命活動中，以及響應干旱、低溫、鹽脅迫、磷脅迫、硫酸鹽脅迫等逆境生理代謝中均發揮著重要作用［9］。miRNA169 家族是擬南芥中最大的miRNA 家族，其在干旱［10-11］、低溫［12-13］、高鹽［14］、氮缺乏［15］以及紫外線輻射［16］條件下表達量均上調，可見其在植物非生物脅迫應答中的重要作用，目前研究人員僅對少數成員進行了功能注釋，但對其功能的研究仍較少。有研究表明，miRNA169d是介導擬南芥低溫早花的關鍵因子，低溫脅迫能夠誘導miRNA169d 表達量上調，再通過一系列信號轉導，最終導致花期提前［17］。前期的研究發現，低溫也能夠誘導煙草miRNA169 表達量上調，這意味著煙草miRNA169 在低溫誘導煙草早花的過程中可能也起著關鍵作用。然而，目前的研究主要集中于miRNA 的形成機制上，對于轉錄水平上如何調控miRNA基因表達的報道很少，尤其是調控煙草miRNA169 家族表達的分子機制研究仍為空白［18］。因此，對煙草miRNA169 家族的表達在轉錄水平上的調控研究，將有助于解決煙草早花的問題。

啟動子是一段可以和RNA 聚合酶以及一些影響轉錄的反式作用因子結合而準確有效地起始轉錄的DNA 序列。啟動子在植物基因表達調控過程中起著關鍵作用。基因的啟動子中含有一系列特異的蛋白結合位點，通常這些位點稱為順式作用元件（cis-element），與順式作用元件相結合的蛋白質被稱為反式作用因子（trans-acting element）。DNA上的順式元件與反式作用因子等多種因素通過相互作用來調控基因的轉錄，即轉錄的組合控制。非生物脅迫，如干旱、高鹽、低溫和高溫等可以誘導植物體內相關基因表達，其轉錄調節的主要機制之一是逆境脅迫有關的轉錄因子（調節蛋白）與基因上游啟動子中關鍵順式元件特異性結合，增強了啟動子的活性，從而提高目的基因的表達量［19］。而研究基因的啟動子及其順式作用元件將有助于了解基因在轉錄水平上的調控機制，因此，利用生物信息學方法對miRNA 序列數據庫（miRBase）［20］中登錄的普通煙草miRNA169 基因家族進行分析，并對其啟動子的序列、理化性質、調控元件等進行預測，旨在明確煙草miRNA169 的調控機制，為培育耐低溫抗早花的煙草新品種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 數據來源

普通煙草（Nicotiana tabacum）miRNA169 序列及其前體序列和擬南芥（Arabidopsis thaliana）pre-miRNA16 9 序列均來源于miRNABase 數據庫（http：//www.mirbase.org/）：nta-miRNA169a（MIMAT0024667；MI002 1357）、nta-miRNA169b（MIMAT0024668；MI0021358）、nta-miRNA169c（MIMAT0024669；MI0021359）、nta-miR NA169d（MIMAT0024670；MI0021360）、nta-miRNA169e（MIMAT0024671；MI0021361）、nta-miRNA169f（MIMA T0024672；MI0021362）、nta-miRNA169g（MIMAT00246 73；MI0021363）、nta-miRNA169h（MIMAT0024674；MI 0021364）、nta-miRNA169i（MIMAT0024675；MI002136 5）、nta-miRNA169j（MIMAT0024676；MI0021366）、ntamiRNA169k（MIMAT0024677；MI0021367）、nta-miRNA 169l（MIMAT0024678；MI0021368）、nta-miRNA169m（MIMAT0024679；MI0021369）、nta-miRNA169o（MIM AT0024680；MI0021370）、nta-miRNA169p（MIMAT0024 681；MI0021371）、nta-miRNA169q（MIMAT0024682；MI0021372）、nta-miRNA169r（MIMAT0024683；MI0021 373）、nta-miRNA169s（MIMAT0024684；MI0021374）、nta-miRNA169t（MIMAT0024685；MI0021375）；ath-miR NA169a（MI0000212）、ath-miRNA169b（MI0000976）、ath-miRNA169c（MI0000977）、ath-miRNA169d（MI0000 978）、ath-miRNA169e（MI0000979）、ath-miRNA169f（MI 0000980）、ath-miRNA169g（MI0000981）、ath-miRNA169 h（MI0000982）、ath-miRNA169i（MI0000983）、ath-miRN A169j（MI0000984）、ath-miRNA169k（MI0000985）、athmiRNA169l（MI0000986）、ath-miRNA169m（MI000098 7）、ath-miRNA169n（MI0000988）。普通煙草全基因組數據來源于中國煙草基因組數據庫。

1.2 煙草miRNA169 基因的生物信息學分析

使用DNAMAN6.0 和MEGA5.0 軟件對煙草miRNA169 家族前體序列進行比對分析，并將其定位在相應的煙草基因組上。其次，截取pre-miRNA169 起始位點上游2 000 bp 序列作為預測啟動子，利用在線分析軟件對潛在的啟動子區域及CpG 島［CpG 島是富含CpG（胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤）二核苷酸的一些區域，通常位于基因啟動子的核心序列和轉錄起始點附近］等進行預測。最后，綜合運用PlantPAN2.0 數據庫和PlantCARE 數據庫對煙草miRNA169 啟動子進行結構分析，預測可能存在的順式作用元件。采用的軟件見表1。

2 結果與分析

2.1 煙草miRNA169 及其前體序列分析

對miRBase 數據庫中的煙草miRNA169 及其前體序列進行整理，共19 個成員，均由21 個堿基組成。其中，nta-miRNA169q、nta-miRNA169r、nta-miR NA169s 的序列完全一致，除nta-miRNA169t 外的其他15 個成員序列完全一致，見表2。

對煙草miRNA169 前體序列進行比對發現：除nta-miRNA169j、nta-miRNA169q 外，其他家族成員前體序列均能完全匹配到煙草基因組上。其中，nta-miRNA169a、nta-miRNA169c、nta-miRNA169i 和nta-miRNA169k 的前體序列基本一致，nta-miRNA16 9b、nta-miRNA169e 和nta-miRNA169g 的前體序列基本一致，nta-miRNA169d 和nta-miRNA169l 前體序列基本一致，nta-miRNA169f 和nta-miRNA169o 的序列完全相同。通過構建系統發育樹（圖1）可以看出，煙草miRNA169 前體序列與擬南芥miRNA169 前體序列明顯分化成為兩個進化分支。除nta-miRNA1 69t 前體序列與擬南芥miRNA169 前體序列存在較高同源性外，其他序列與擬南芥之間的同源性均很低，但煙草miRNA169 前體序列之間存在很高同源性，因此推測煙草miRNA169 的調控機制可能與擬南芥miRNA169 的調控機制存在差異。

表1 生物信息學分析及使用軟件Tab.1 Bioinformatic analysis and corresponding software

表2 煙草miRNA169 及其前體的序列特征Tab.2 Sequence characteristics of miRNA169 and pre-miRNA169

圖1 煙草pre-miRNA169 家族系統發育樹Fig.1 Phylogenetic tree of pre-miRNA169 family

對煙草miRNA169 前體序列進行染色體定位發現：煙草miRNA169 前體序列主要分布在chr01、chr08 和chr09 這3 條染色體上。其中，chr09 上的pre-miRNA169 主要分為兩個轉錄起始位點，chr08上的pre-miRNA169 轉錄起始位點呈現多樣化，而chr01 上 只 有1 個pre-miRNA169t。此 外，大 部 分miRNA169 均存在多種前體序列，推測有某種機制將同一段序列加工成不同的pre-miRNA，見圖2。最后，根據轉錄起始位置的不同將煙草pre-miRNA169 劃分為8 組，見表3。

2.2 煙草miRNA169 啟動子區域預測

截取上述8 組pre-miRNA169 序列5’側翼區2 000 bp 的序列作為啟動子預測區域，利用啟動子在線分析軟件Promoter 2.0 Prediction Server、Neural Network Promoter Prediction（截斷值0.8）、Softberry（TSSP）進行啟動子預測。綜合3 種軟件的預測結果及各miRNA169 前體序列的分布位置，推測出煙草miRNA169 啟動子最有可能存在的位置，結果見表4。其中，Promoter 2.0 Prediction Server 只預測到nta-miRNA169s 在800 bp 處有很高的可能性存在啟動子，Softberry（TSSP）對pre-miRNA169 在反義鏈上的啟動子預測效果不佳。

2.3 煙草miRNA169 啟動子CpG 島預測

CpG 島的GC 含量大于50%，長度超過200 bp。有研究表明，miRNA 基因啟動子區域的CpG島如果被甲基化，將會阻礙相關轉錄因子的結合，從而降低miRNA 的表達［21］。

本研究中利用MethPrimer 軟件在線分析，采用參數觀察值/預測值＞0.6、GC 含量＞50.0%，對煙草miRNA169 啟動子進行CpG 島預測，結果見圖3。所有煙草miRNA169 的啟動子區域GC 含量都比較低，未發現明顯的CpG 島。

圖2 煙草pre-miRNA169 家族染色體定位Fig.2 Chromosomal localization of pre-miRNA169 family

表3 煙草pre-miRNA169 分組Tab.3 Group of pre-miRNA169

表4 煙草miRNA169 啟動子區域預測結果Tab.4 Promoter prediction results of pre-miRNA169

圖3 煙草miRNA169 啟動子CpG 島的預測結果Fig.3 Prediction results of CpG island in miRNA169 promoter

2.4 煙草miRNA169 脅迫相關元件的預測

由于部分煙草miRNA169 在染色體上位置及預測的啟動子區域基本沒有差別，因此將miRNA169a 作為miRNA169a、miRNA169c、miRNA16 9k、miRNA169i、miRNA169b、miRNA169d、miRNA169e、miRNA169g、miRNA169l、miRNA169j 的 代 表，miR NA169r 作 為miRNA169f、miRNA169o、miRNA169h、miRNA169m、miRNA169p、miRNA169r、miRNA169q、miRNA169s 的代表，分別截取上游2 000 bp 序列預測可能存在的脅迫相關元件。

運用PlantPAN2.0 對煙草miRNA169 啟動子序列進行分析，結果見表5 和圖4。從脅迫相關元件的種類和數量分布來看，這3 條啟動子序列存在很高相似性。

運用PlantCARE 對上述煙草miRNA169 啟動子序列上的脅迫相關元件進行驗證［22］，結果見表6。經過篩選，煙草miRNA169a 啟動子中存在5 個干旱應答元件MBS 和1 個低溫應答元件LTR，煙草miRNA169r 啟動子中存在4 個干旱應答元件MBS、1 個低溫應答元件LTR 和1 個脫落酸應答元件ABRE，煙草miRNA169t 啟動子中存在1 個干旱應答元件MBS、1 個低溫應答元件LTR 和5 個脫落酸應答元件ABRE。通過脅迫相關元件的預測分析，已測定煙草miRNA169 基因的啟動子序列中都存在干旱應答元件和低溫應答元件，表明已測定的煙草miRNA169 基因均參與低溫應答和干旱應答，這與上述研究結果相符。

3 討論

本研究中發現煙草基因組中共有19 個miRNA169 基因，分別分布在1 號、3 號和8 號染色體上，各miRNA169 基因產生的miRNA169 序列基本相同，推測煙草miRNA169 家族各個成員可能參與相似的信號通路。然而，miRNA169 家族的前體序列具有較大的差異，推測可能存在不同的觸發機制來形成相應的miRNA169，這與不同的miRNA169 參與植物不同的脅迫反應是相印證的，如在紫外線誘導下miRNA169d、miRNA169j 表達量上升［16］，在干旱處理下miRNA169g 表達量上升［23］。

進化分析顯示，除miRNA169t 外，煙草miRNA169 與擬南芥miRNA169 的序列同源性并不高，說明煙草miRNA169 與擬南芥miRNA169 在進化上可能來源于兩個分支。因此，推測煙草miRNA169 的功能可能有別于擬南芥miRNA169，需要在煙草上進行進一步的試驗驗證。

miRNA169家族參與了植物抵御干旱、低溫等多種非生物脅迫，以及激素應答等多種生理過程［11-16］。本研究中發現，煙草miRNA169 啟動子區域中存在多種非生物脅迫應答元件和激素應答元件，證實了煙草miRNA169 在復雜的非生物脅迫調控網絡中扮演著重要角色。其中，所有煙草miRNA169 啟動子區域都存在低溫應答元件LTR［24］，說明低溫脅迫相關的轉錄因子通過與煙草miRNA169 啟動子區域中的低溫應答元件LTR 相結合來誘導煙草miRNA169 的上調表達，這與低溫誘導植物miRNA169 上調表達的試驗結果相一致［17］。此外，煙草miRNA169 啟動子區域中還存在脫落酸（ABA）和茉莉酸（JA）應答元件。由于植物激素在植物抵御各種生物和非生物脅迫過程中發揮著重要的調節作用，而ABA 和JA 是植物體內參與抵御各種生物和非生物脅迫過程最重要的內源激素［25］，有研究表明ABA 和JA 均參與植物對低溫脅迫的應答［26］。因此，推測煙草miRNA169 對低溫脅迫的響應過程可能依賴于ABA 和JA 途徑。而在通過轉基因技術創制過表達或基因沉默材料，對煙草miRNA169 抵御低溫脅迫過程中的功能進行驗證，并嘗試解析其調控機制方面仍有待進一步深入研究。

圖4 煙草miRNA169 啟動子區域脅迫相關元件的分布Fig.4 Distribution of stress-related elements in miRNA169 promoter

圖4 （續）

圖4 （續）

表6 煙草miRNA169 啟動子區域脅迫相關元件驗證Tab.6 Verification of stress-related elements in miRNA169 promoter

4 結論

煙草基因組中共有19 個miRNA169 基因，分布在1 號、3 號和8 號3 條染色體上，同一染色體上的miRNA169 分布集中。對煙草miRNA169 啟動子的分析發現，煙草miRNA169 與擬南芥miRNA169 的序列同源性不高，可能屬于不同的進化分支。另外，在所有煙草miRNA169 的啟動子上均存在低溫脅迫應答元件LTR，以及參與低溫應答的激素ABA 和JA 的應答元件。因此，推測煙草miRNA169 對低溫脅迫的響應過程可能是LTR、ABA 和JA 途徑三者共同作用的結果。