應用人造口腔模擬擠壓裝置研究口含煙煙堿釋放的影響因素

田永峰，李 鵬，劉 澤，孫世豪，董高峰，張 杰，王昆淼，段沅杏，湯建國，楊 柳，楊 繼，陳永寬，繆明明，劉志華*

1.云南中煙工業有限責任公司技術中心，昆明市五華區紅錦路367 號 650231

2.中國煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術產業開發區楓楊街2 號 450001

3.上海煙草集團有限責任公司北京卷煙廠，北京市通州區萬盛南街99 號 100024

口含煙包括嚼煙（chewing tobacco）、瑞典含煙（snus）、美式含煙（moist snuff）、煙草膏（tobacco paste）、牙 粉（tooth powder）、可 溶 煙 草 片（dissolvable tobacco）等，目前主要的市售產品為瑞典含煙和美式含煙［1-3］。口含煙最早出現于17 世紀，1730 年美國成立了口含煙加工廠，1822 年第一個口含煙品牌“Ettan”誕生于瑞典［1］。口含煙由于無須燃燒、不產生煙氣，因此具有使用場所不受限制的特點。隨著全球控煙形勢的日趨嚴峻，口含煙因其獨特的使用方式而成為解決公共場所吸煙和消除環境影響的有效解決方案，并成為各國煙草公司的研究重點之一［2］。口含煙使用時，將其放入唇部和牙齦之間，煙堿經口腔黏膜吸收后進入血液，進而使消費者獲得生理滿足感。因此，使用口腔模擬裝置研究口含煙中煙堿釋放的影響因素對于該類產品的配方開發、工藝優化及質量評價具有重要意義［3］。張杰等［4-5］使用一種模擬裝置分析了無煙氣煙草制品的煙堿體外釋放特征；張文娟等［6］對上述模擬裝置進行了改進，并研究了膠基型無煙氣煙草制品中煙堿的釋放行為；李鵬等［7］考察了行業標準方法在測試口含煙化學指標中的適用性；段沅杏等［8］測定了口用型無煙氣煙草制品中的煙堿含量。目前，口含煙相關研究中主要參考行業標準方法中的前處理方法及色譜質譜檢測條件，針對口含煙分析裝置及方法的報道較少，煙堿釋放的影響因素研究也不夠深入、全面。為此，本研究中使用自主研發的能夠模擬唇齒之間擠壓力的口腔模擬溶出裝置，考察口含煙含水率、煙粉粒徑和pH 對口含煙煙堿釋放率的影響，旨在為口含煙的質量評價及煙堿釋放調控提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

不同含水率、煙粉粒徑和pH 的Showker Mint系列口含煙樣品，由云南中煙工業有限責任公司根 據Swedish Match GothiaTek?standard［9］制 備。樣品含水率分別為11%、32%和51%，煙粉粒徑分別為180 μm（10 目）、380 μm（40 目）和1 700 μm（80 目），pH 分別6.7、7.5 和8.4。實驗前所有樣品均密封儲存于冰箱中，樣品信息見表1。

表1 樣品信息Tab.1 Sample information

甲醇（色譜純，德國Merck 公司）；氯化鎂（分析純，上海麥克林生化科技有限公司）；磷酸氫二鉀（分析純，天津市風船化學試劑科技有限公司）；苯甲酸鈉、山梨酸（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；氯化鈉、氯化鈣、氯化鉀（分析純，西隴化工股份有限公司）；實驗中所用3 種人工唾液［10］的配方見表2。

Agilent 1260 高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；口腔模擬溶出裝置［11］（云南中煙工業有限責任公司研發）；BT100-02 恒流泵（保定齊力恒流泵有限公司）；PHS.3C 型pH 計（上海精密科學儀器有限公司）；Milli-Q50 超純水儀（美國Millipore 公司）；CP2245 型電子天平（感量：0.000 1 g，德國Sartorius 公司）。

表2 人工唾液配方組成Tab.2 Artificial saliva formulation

1.2 方法

1.2.1 口腔模擬溶出裝置組成

口腔模擬溶出裝置見圖1。該裝置主要包括集液器（1）、模擬溶出主機（3）、兩臺相同規格的蠕動泵（2、4）、模擬口腔組件（5）、砝碼組件（6）和唾液采集盤（9）。其中模擬溶出主機（3）由擠壓機械手（7）和模擬口腔（8）組成。

1.2.2 口腔模擬溶出裝置工作原理

圖1 體外煙堿溶出口腔模擬裝置示意圖Fig.1 Schematic diagram of a buccal cavity simulator for in vitro release of nicotine

圖2 體外煙堿溶出口腔模擬裝置工作原理示意圖Fig.2 Schematic diagram of working principle of buccal cavity simulator for in vitro release of nicotine

如圖2 所示，該裝置通過步進電機驅動口腔模擬組件往復運動并結合磁力控制最終實現口腔開合動作，通過配合不同質量砝碼搭配可實現不同擠壓力設定，通過蠕動泵可實現唾液流量調整。模擬口腔包括溶液皿和開合導向槽。其中，溶液皿具有進液管和出液管；開合導向槽則位于溶液皿內部，具有一對夾合組件。夾合組件包括唇板、固定在唇板上的夾板及位于夾板底部的電磁鐵，通過調節磁力可實現模擬口腔的開合。模擬口腔的溶液皿用于放置樣品和人工唾液，溶液皿底部適配加熱板及加熱管，用于保持溶液皿內的恒溫環境。通過設置開合導向槽的開合度可實現模擬口含煙使用過程中的口腔環境，擠壓機械手的上下移動可實現模擬唇部對口含煙的擠壓動作。

實驗中，將人工唾液泵入儲液瓶中，并置于恒溫槽內保持恒溫，由蠕動泵泵入人工唾液。出液管路與集液器相連，該部分包含15 工位（14 個10 mL 試劑瓶和1 個廢液排出管）唾液采集盤、旋轉驅動步進電機（閉環控制）、驅動同步輪和同步帶及支架主體。該裝置由電腦控制，除具有咀嚼功能外，還具有唇部蠕動、唾液自動定量收集等功能，可以實現樣品的自動擠壓和溶出液的實時在線采集。

1.2.3 口含煙煙堿體外溶出實驗

將人工唾液加入儲液瓶中，置于37 ℃水浴鍋內；開啟蠕動泵，待系統穩定至37 ℃后，設定模擬溶出裝置參數；將口含煙樣品放入溶液皿內并開始計時，分別在2、4、6、8、10、15、20、25、30 min 時收集人工唾液，每次收集后立即檢測人工唾液中煙堿含量；收集人工唾液30 min 后，取出口含煙殘留樣品，置于50 mL 三角瓶中備用。

1.2.4 煙堿釋放率檢測

利用高效液相色譜儀檢測樣品中的煙堿。色譜柱：Waters XTerra C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相A：甲醇，B：20 mmol 的磷酸鹽緩沖溶液（0.2%三乙胺，pH 6.0），A∶B 為18∶82；流動相流速：1.0 mL/min；柱溫：35 ℃。

1.2.5 煙堿釋放率分析

將口含煙殘留樣品的小袋剪開并連同小袋一起放入50 mL 三角瓶中；加入20 mL 乙醇與5%NaOH溶液（體積比9∶1）的混合溶液，超聲萃取30 min；將煙堿人工唾液和殘留樣品萃取液分別過0.45 μm濾膜后，采用HPLC 進行定量檢測；根據定量結果計算煙堿累計釋放率，并繪制煙堿釋放曲線。煙堿累計釋放率由一段時間的煙堿釋放量除以樣品總煙堿量計算，其中樣品總煙堿量為樣品30 min的煙堿釋放量與殘留樣品中煙堿量的總和。

1.2.6 數據處理

采用SPSS 17.0 軟件對煙堿釋放結果進行t 檢驗，取顯著水平0.05，定量結果以均值±標準差表示。

2 結果與討論

2.1 口含煙煙堿口腔模擬溶出檢測方法評價

2.1.1 檢出限和定量限

取pH 5.2 的人工唾液分別配制質量濃度為5、20、50、100、200、400、600、1 000 μg/mL 的煙堿標準溶液，采用HPLC 進行分析，每個樣品重復3 次并取平均值，以煙堿質量濃度（x，μg/mL）對煙堿峰面積（y）進行線性回歸分析，得到煙堿的標準工作曲線為y=10.60 x-11.72，R2=0.999 9。分別以3倍和10 倍信噪比計算方法的檢出限和定量限，分別為3.9 和13.0 μg/g。

2.1.2 精密度和回收率

取口含煙樣品Showker Mint（1#），分別按照低、中、高3 種水平加入煙堿標準品，每個添加水平均重復5 次。將加標樣品按優化的方法進行前處理，連續測定6 d。方法的精密度和回收率結果見表3。可以看出，方法的日內精密度為0.87%～3.35%，日間精密度為3.52%～4.91%，加標回收率94.2%～98.5%，表明本方法可以滿足定量要求。

表3 方法精密度與回收率Tab.3 Recovery and precision of the method

2.2 人工唾液使用條件的確定

使用表2 所示的人工唾液配方測定口含煙煙堿釋放率，結果顯示，在3 種人工唾液中口含煙煙堿的釋放率均超過99%，可以滿足實驗要求。煙堿在酸性條件下呈質子化形態分布，堿性條件下向游離態轉化，為使煙堿更快速地溶解在人工唾液中，本研究中選擇3#人工唾液。據文獻［12］報道，人體在未接受刺激的條件下，唾液分泌速度約為0.06～1.8 mL/min，而在強烈刺激條件下，唾液的分泌速度會增加。鑒于口含煙煙堿會對使用者產生刺激，使唾液分泌速度加快，因此本研究中選擇人工唾液流速2 mL/min。通常，人體口腔溫度在36.3～37.2 ℃之間，國內外口含制劑溶出度測定中通常選擇37 ℃，因此，本研究中通過恒溫槽、加熱線圈、溫度傳感器使實驗體系維持在（37.0±0.1）℃。

2.3 口含煙品質影響因素分析

2.3.1 含水率對口含煙煙堿釋放率的影響

國際市場市售無煙氣煙草制品的含水率在8%～55%之間［13-15］，因此制備了含水率分別為11%、32%、51%的樣品進行分析。每種樣品取3 個平行，按1.2 節方法進行口含煙煙堿釋放實驗，煙堿釋放率如圖3 所示。可以看出，含水率對煙堿釋放有一定的影響，含水率高的樣品在初始2 min的煙堿釋放率提高約40%。在煙草物料中，煙堿的釋放需先經歷吸收水分溶出的過程，因此口含煙樣品接觸人工唾液后，煙堿的釋放存在一定的滯后，此過程約為20～50 s。含水率低的樣品吸水過程時間長，其煙堿釋放較慢。本研究中，3 個不同含水率樣品在使用30 min 后其煙堿釋放率均超過95%，說明含水率較高時，不同樣品的煙堿釋放行為差異較小。

圖3 不同含水率口含煙煙堿釋放率Fig.3 Release rates of nicotine from snus with different moisture contents

2.3.2 pH 對煙堿釋放的影響

通常，無煙氣煙草制品的pH 在6.0～8.5 之間［16-17］，因 此 制 備 了pH 分別為6.7、7.5 和8.4 的樣品進行分析。每種樣品取3 個平行，按1.2 節方法進行口含煙煙堿釋放實驗，煙堿釋放率如圖4所示。可以看出，不同pH 口含煙的煙堿釋放速率具有顯著差異（P＜0.05）。3 種不同pH 樣品煙堿釋放率隨樣品pH 的增大而減小，這是由于煙堿在堿性條件下主要以游離態存在，相反則主要以質子化形態存在，質子化的煙堿更易溶于水中，因此，與pH 高的樣品相比，pH 低的樣品中煙堿釋放率更快。

圖4 不同pH 口含煙煙堿釋放率Fig.4 Release rates of nicotine from snus with different pH values

有研究表明，煙草制品中游離煙堿的含量是影響產品生理滿足感的重要因素，其與pH 呈正相關［18-20］。因此，調節pH 是提高煙草制品中游離煙堿含量的有效途徑。艾明歡等［21］研究了口含煙原料中游離煙堿與含水率和pH 的關系，結果表明，在相同的游離煙堿變化量下，不同煙草原料pH 變化幅度為1 時對應的含水率變化量為0.4%～1.0%。由于口含煙中含水率可調范圍廣，因此，與pH 調節法相比，含水率調節是更加有效的口含煙游離煙堿含量調節途徑。

2.3.3 煙粉粒徑對煙堿釋放的影響

圖5 不同煙粉粒徑煙堿釋放率Fig.5 Release rates of nicotine from snus with tobacco powder of different particle sizes

通過對無煙氣煙草制品的分析發現，其顆粒分布于10～80 目之間。因此選擇10、40 和80 目3個樣品進行分析。每組樣品取3 個平行，按照1.2節方法進行口含煙煙堿釋放實驗，煙堿釋放率如圖5 所示。可以看出，不同煙粉粒徑的口含煙煙堿釋放速率存在顯著差異（P＜0.05），煙堿的釋放速率隨著煙粉粒徑的減小快速增加，80 目樣品的煙堿釋放率是10 目樣品的3 倍。可見，煙粉粒徑是調節口含煙制品中煙堿釋放率的關鍵影響因素。原因是，隨著煙粉粒徑的減小，煙粉與唾液的接觸面積增加，進而使煙堿釋放加快。實驗中發現，煙粉粒徑大的樣品的煙堿釋放較為持久和柔和，而顆粒小的樣品在開始的6 min 內其煙堿釋放率已超過90%。因此，建議使用煙粉粒徑較大的煙草原料制備口含煙，以使煙堿的釋放更緩和。

2.4 口含煙品質影響因素模型

含水率、煙粉粒徑和pH 對口含煙煙堿釋放率的影響符合指數函數，a 和b 為常數。不同影響因素下口含煙的煙堿釋放率可由方程（1）計算。其中a 和b 值見表4。不同含水率條件下，隨著含水率的升高煙堿釋放率呈加快趨勢，不同pH 條件下，隨著pH 的升高煙堿釋放率呈降低趨勢。不同煙粉粒徑條件下，隨著煙粉粒徑的減小，煙堿釋放率呈增大趨勢。上述模擬結果與2.3 中實驗結果一致，不同條件下R2均大于0.95，說明該方程擬合效果良好。

表4 不同條件下煙堿的釋放率方程參數Tab.4 Fitting equation parameters of release rates of nicotine from snus under different conditions

3 結論

開發了一套新型口腔模擬溶出裝置，并通過與高效液相色譜法結合建立了一種參數可控、結果可靠的口含煙煙堿體外模擬溶出研究方法。口含煙中含水率對煙堿的釋放時間影響較顯著，但含水率超過30%后，煙堿釋放速率差異不明顯。不同口含煙原料中煙堿在堿性條件下均能快速溶出。口含煙煙粉粒徑對煙堿釋放率的影響最顯著，當煙粉粒徑1 700 μm 時，在模擬口腔環境中6 min 內煙堿的釋放率已超過90%，而煙粉粒徑較大的煙草原料中煙堿的釋放在前10 min 內較緩慢。3 個影響因素擬合模型為指數方程，擬合系數R2大于0.95，適用于模擬不同條件影響下口含煙煙堿的釋放率。本研究結果可為口含煙的質量評價、煙堿釋放調控提供技術支持。