羊膜淚小管支架治療去勢雄兔干眼癥的實驗研究

黎 彪，袁 晴，朱佩文，林 啟，閔幼蘭，石文卿，葉 蕾，邵 毅

0引言

現如今，由于激素水平的改變、長時間閱讀或使用電腦、屈光手術、角結膜接觸鏡的使用、頻繁滴用眼藥水等因素的影響，干眼癥在世界各地的發病率有上升趨勢，可達5%～35%，其作為導致慢性眼表疾病最常見原因之一，是一種治療較為困難的慢性疾病[1-3]。由于淚膜穩定性下降，引起患者視疲勞、眼干、持續性紅腫、視力波動、眼內異物感等不適，嚴重影響了患者的生活質量[4]。目前，針對不同的病因和患者自身的情況，治療干眼癥的方法主要有抗炎藥物、抗氧化劑[5]、人工淚液、激素替代治療、淚道栓塞等，但均存在不良反應，療效也不盡相同。其中淚道栓塞對于患者的治療有較好的效果，但由于材料的局限性，對患者可能帶來較強的異物感而不易被接受。

羊膜淚小管支架以羊膜為主要材料，將其填入淚道，可以通過堵塞淚道的方式，一定程度上保留殘留淚液，從而達到治療干眼癥的目的。同時，相比于目前常用的材料，羊膜淚小管支架具有抑制新生血管形成、抗原性低、炎性反應輕和抑制瘢痕增生等優勢[6-7]。現為探究羊膜支架栓塞淚小管對手術閹割雄兔干眼癥的治療作用，為淚小管栓塞治療干眼癥提供實驗依據。

1材料和方法

1.1材料成年新西蘭雄兔，體質量1.5～2.0kg(由南昌大學醫學院動物中心提供)，使用裂隙燈顯微鏡和眼底顯微鏡篩選出36只無眼疾的健康雄兔，在安靜且恒溫的環境下喂養。將36只雄性兔隨機均分為3組，每組12只，其中A組為假閹割手術組，B組為假植入組，C組為羊膜淚小管支架組。本次實驗全部選用雄兔的右眼進行，實驗期間保持對所選雄兔的正常飼養。本實驗研究符合動物倫理委員會的要求[8]，充分考慮了實驗動物的利益，減少對實驗動物損傷和痛苦，尊重動物的生命。

1.2方法

1.2.1手術方法本次實驗所有操作和檢查均由同一人于相同操作條件下完成。切去所選36只雄兔的第三眼瞼，在眼部抗感染下喂養1wk。參照馬軼群等[9]方法，對36只雄兔進行分組，分組情況如前述，B、C兩組行雙側睪丸切除術，去除辜丸及附辜，術中對精索靜脈和輸精管行縫線打結，以閹割雄兔去勢。其中，對于A組雄兔僅切開陰囊，不切除睪丸，術后不進行其他處理。檢查造模后的所有雄性兔，B、C兩組兔角膜干燥、少光澤，角膜熒光素染色(FL)可見散在的點狀潰瘍。所有造模兔淚液分泌試驗(SⅠt)均<10mm/5min則造模成功。B、C兩組植入羊膜淚小管支架(圖1)：B組為陽性空白對照組，于閹割當日植入羊膜淚小管支架10s后取出，觀察其眼部情況；C組為實驗組，閹割手術當日植入羊膜淚小管支架。分別于植入前和植入后2、4、6wk行FL染色和SⅠt檢查，并使用共焦顯微鏡觀察角膜神經變化。

1.2.2淚小管羊膜生物力學特性測定參照文獻[10]，由同一操作者將淚小管羊膜切割，獲取3.5cm×1.0cm的實驗樣本，將淚小管羊膜放在符合傳感器中施力拉伸，待其斷裂后記錄其抗拉強度(MPa)、斷裂伸長率(%)和彈性模量(MPa)。

1.2.3淚液分泌試驗彎折刻度濾紙，置于眼內結膜囊的中外1/3處，5min后取出濾紙，量其浸潤長短。按照文獻的標準[11]，若所量得長度<5mm/5min則為干眼。

1.2.4 FL染色和評分于雄兔的結膜囊內滴1%熒光素鈉，使其眨眼，獲取其FL圖像并觀察角膜上皮的染色情況。采用12分法進行評分[12]：角膜分4個區域，每區域得分0～3分，0分：未見染色；1分：染色<5個點；2分：染色≥5個點；3分：≥5個點并有潰瘍或絲狀物染色。

1.2.5共焦顯微鏡檢查檢查實驗兔角膜神經的變化情況，用非侵入性共聚焦顯微鏡掃描角膜神經，具體操作參考文獻[13]：固定兔頭，用5g/L鹽酸丙美卡因滴眼液表面麻醉兔眼，調整實驗兔，使其平視正前方，每次操作由同一操作者逐漸慢速推進鏡頭，中央角膜處行全層掃描，獲取所需角膜神經圖像。

1.2.6神經密度的測定為單個圖像中神經纖維的總長度。通常在35～50μm的深度觀察角膜下神經叢。角膜下神經纖維的長度由AUTOCAD軟件確定。為了計算神經纖維密度，調整每個圖像的尺度，使得每幀對應于0.16mm2(400μm×400μm)的實際角膜面積。使用折線命令描繪神經纖維的形狀。所有的神經纖維被描繪在單個圖像中，然后復制所有描繪的折線(圖2)，所有折線的總長度通過折線的特征來確定。隨后，將測得總長度除以面積(0.16mm2)，即神經纖維密度(mm/mm2)。

2結果

2.1淚小管支架的生物力學特性比較羊膜淚小管支架的抗張強度為0.709±0.187MPa，斷裂伸長率為15.653%±3.023%，而羊膜淚小管支架彈性模量為3.132±1.382MPa，顯示淚小管羊膜有一定彈性和抗拉伸性能。

2.2三組羊膜淚小管支架植入前后FL染色與SⅠt結果比較植入羊膜淚小管支架前后，各組FL染色圖像：(1)A組角膜表面光滑、清晰，FL染色不明顯(圖3A、D)；(2)B組角膜表面粗糙，角膜上皮可見點片狀染色(圖3B、E)；(3)C組角膜表面較假手術組更為光滑、清晰，無明顯點狀染色(圖3C、F)。三組不同時間的FL評分和SⅠt結果比較，采用重復測量數據的方差分析：(1)三組間FL評分比較，差異有統計學意義(F組間=18.542，P組間=0.004；F時間=16.858，P時間=0.007；F交互=13.653，P交互=0.009)；(2)三組間SⅠt結果比較，差異有統計學意義(F組間=15.764，P組間=0.011；F時間=19.781，P時間=0.007；F交互=22.251，P交互=0.003)。植入淚小管支架前，三組間FL評分和SⅠt兩兩比較，差異無統計學意義(均P>0.05)。羊膜淚小管支架植入6wk后，C組FL評分和SⅠt與植入前比較，差異有統計學意義(均P<0.05)；且B組FL評分和SⅠt與植入前比較，差異有統計學意義(均P<0.05)。B組和C組植入淚小管支架后2、4、6wk時三個時間點FL評分和SⅠt結果兩兩比較，差異有統計學意義(均P<0.05，表1)。

圖1B、C組羊膜淚道支架植入示意圖A：麻醉后充分暴露兔眼淚小點；B～D：用眼科顯微平鑷將羊膜淚小管支架沿淚小管走形植入，圖B部分植入(植入10s后取出)，圖C大部分植入(植入后保留6wk)，圖D完全植入。

組別眼數干預前干預后2wk干預后4wk干預后6wkFL染色(分) A組121.05±0.401.04±0.220.96±0.281.07±0.31 B組121.00±0.452.10±0.53e3.12±0.64e3.35±0.73e C組121.10±0.331.94±0.64a,c,e2.91±0.91a,c,e3.06±0.75a,c,eSⅠt(mm/5min) A組129.84±1.959.92±1.959.85±2.069.97±1.99 B組129.69±1.557.63±1.65e6.24±1.99e4.58±1.61e C組129.96±1.648.41±2.04a,c,e6.64±1.06a,c,e5.11±1.30a,c,e

注：A組：假閹割手術組；B組：假植入組；C組：羊膜淚小管支架組。aP<0.05vsA組；cP<0.05vsB組；eP<0.05vs干預前。

組別眼數干預前干預后2wk干預后4wk干預后6wk神經纖維密度(mm/mm2) A組1220.16±4.9920.09±4.54e20.96±4.73e20.21±4.85e B組1216.67±2.4116.22±2.55e16.89±2.59e16.39±2.76e C組1216.19±2.3917.12±2.61a,c,e18.93±3.12a,c,e19.14±3.51a,c,e纖維分支(分支數/圖) A組1210.54±3.0510.54±2.91e10.77±2.95e10.47±2.63e B組127.63±2.517.53±2.45e7.44±2.61e7.52±2.44e C組127.72±2.628.06±2.73a,c,e8.67±2.86a,c,e9.17±2.55a,c,e曲率評分 A組123.29±0.693.31±0.62e3.27±0.71e3.34±0.66e B組121.82±0.621.89±0.69e1.84±0.53e1.79±0.52e C組121.86±0.662.05±0.81a,c,e2.69±0.86a,c,e3.16±0.74a,c,e

注：A組：假閹割手術組；B組：假植入組；C組：羊膜淚小管支架組。aP<0.05vsA組；cP<0.05vsB組；eP<0.05vs干預前。

圖2神經密度的測定A：CAD軟件獲得的共焦顯微圖像中的角膜神經纖維走行(×120)；B：根據共焦顯微圖像中的角膜神經纖維描繪的折線。

2.3各組植入淚小管支架前后角膜共焦顯微鏡圖像結果A組兔角膜上皮下神經顯示為相對直的神經叢，數量多，清晰可見(圖4A)。B組角膜上皮下神經可見彎曲，數量有所減少(圖4B)。C組角膜上皮下神經較直，與正常雄兔角膜上皮下神經相比，數量略有減少(圖4C)。A組雄兔角膜基質內神經為較清晰的直的神經叢(圖4D)。B組角膜基質內神經叢彎曲(圖4E)。C組的角膜基質內神經與正常雄兔角膜基質內神經比較略有彎曲(圖4F)。

2.4各組羊膜淚小管支架植入前后神經檢查定量分析結果三組不同時間的角膜上皮下神經纖維密度、分支或曲率評分結果比較(表2)，采用重復測量數據的方差分析：(1)不同組間神經纖維密度、分支或曲率評分比較，差異有統計學意義(F=6.143、5.280、7.621，P=0.041、0.046、0.036)；(2)不同時間的神經纖維密度、分支或曲率比較，差異有統計學意義(F=6.637、5.748、6.864，P=0.039、0.032、0.044)；(3)三組不同組間不同時間神經纖維密度、分支或曲率評分比較，差異有統計學意義(F=5.547、6.326、5.754，P=0.045、0.036、0.039)。

圖3三組羊膜淚小管支架植入前后FL染色和SⅠt結果A：假閹割手術組角膜表面光滑、清晰，FL染色不明顯；B：假植入組角膜表面粗糙，見點片狀染色；C：羊膜淚小管支架組角膜表面較清晰，無明顯點狀染色；D：假手術組角膜未見有FL染色；E：假植入組角膜上皮見染色斑點；F：羊膜淚小管支架組角膜上皮未見明顯點狀染色。

圖4各組角膜上皮下神經叢和基質內層神經叢的共焦顯微鏡圖像(×120)A、D：假閹割手術組角膜上皮下神經叢、基質內層神經叢，數量多，清晰可見；B、E：假植入組角膜上皮下神經叢、基質內層神經叢，皮下神經可見彎曲，數量有所減少；C、F：羊膜淚小管支架組角膜上皮下神經叢、基質內層神經叢，走形略有彎曲。

3討論

干眼癥作為多因素影響的慢性眼表疾病，其主要是由于淚液的基礎分泌量減少，淚液加快蒸發，淚液質量、淚膜穩定性均降低，從而導致角結膜干燥，出現眼部不適癥狀。淚膜穩定性受神經、體液調節機制的調控。例如，激素水平的變化，尤其是雄激素水平的下降，是干眼發病的關鍵。有研究發現，低雄激素可能導致瞼板腺功能障礙，瞼板受損腺體分泌物減少，淚液蒸發加快[14]。因此，激素替代治療對于干眼癥的治療有著較好的療效。有研究者前期對鬼針草滴眼液預防、醫治閹割雄兔干眼癥做了相關的研究，但其作為激素替代治療的長期不良反應仍難以確定[15-17]。而通過淚小管栓塞方式治療干眼癥，并不會引起患者體內激素水平的改變，極大程度上減少了不良反應的發生。

羊膜是來源于胚胎的透明組織，它本身沒有神經、血管、淋巴管[18]，且有良好的韌性和生物相容性，因此近年來被廣泛用于眼科領域的各種眼表疾病，如眼表化學灼傷、結膜缺損、角膜潰瘍和穿孔、瞼球粘連、角膜炎癥和缺損等[19]。羊膜自身所具有的干細胞和細胞因子可以促進組織修復和愈合、減輕炎癥反應、預防組織粘連等。而羊膜淚小管支架很大程度上繼承了羊膜的特性，其本身并沒有藥物的毒性作用，本實驗結果也表明，羊膜淚小管支架質地較為柔軟，具有良好彈性和韌性，并有一定的彎曲能力和擴張度。且羊膜淚小管支架植入時簡單方便，易于操作。羊膜淚小管支架通過抑制干眼癥患者眼部的炎癥反應，促進淚道上皮功能的恢復，抑制病變組織纖維化，一定程度上改善淚膜的穩定性。同時，此種支架符合淚小管的解剖結構，對淚道的摩擦程度小，極大地減少了機械損傷，并通過淚小管栓塞的方式很大程度上保留了天然淚液，穩定了淚膜的功能，減少了患者眼干等癥狀。

淚小管栓塞較為安全、可靠，其優勢主要體現在以下幾個方面：(1)極大限度地保留了天然淚液，使淚膜穩定；(2)栓子可自動調節其直徑，以適合術眼淚小管內徑；(3)植入后，栓子與淚小管結合緊密，不易脫落；(4)栓子不易發生外漏，降低了眼部異物感出現的幾率和眼部炎癥發生率。而本實驗中的羊膜淚小管支架，便是通過淚小管栓塞的方式對手術閹割雄兔的干眼癥產生作用。

前期的研究表明，羊膜淚道支架對于干眼癥有一定的預防作用，并著重觀察羊膜支架植入前后的FL評分和SⅠt結果，以及角膜共聚焦顯微鏡下角膜上皮基底細胞、炎癥細胞變化情況，而此次研究除了對比羊膜淚小管支架植入前后的FL評分和SⅠt結果外，進一步比較了三組動物干預后不同時間的角膜上皮下神經纖維密度、分支或曲率評分結果。本實驗結果顯示：在植入羊膜淚小管支架后，閹割雄兔干眼癥狀和體征有所改善，表明其對干眼癥的治療有作用。植入6wk后，羊膜淚小管支架組SⅠt、FL評分較治療前有改善，而假植入組則出現了惡化，這說明羊膜淚小管支架通過保留淚液，對淚膜的功能具有穩定作用。這可能是干眼癥進展的自然過程，也可能由于淚液的存留而使淚腺的功能有一定程度的改善。而對角膜上皮下神經基質內神經情況的觀察，可以發現羊膜淚小管支架組角膜上皮下神經和角膜基質層神經干相對直，與正常雄性兔上皮下神經相比，數量有所減少，且支架植入后2wk和4wk神經密度、神經數量有明顯提高，而假植入組和假手術組術后2wk和4wk神經密度、數量增加不明顯，甚至減少。而在假植入組中，角膜上皮下神經和角膜基質層神經干彎曲，數量減少。說明羊膜淚小管支架植入后角膜神經的變性程度更低。相較于治療中常用的淚道栓子，羊膜淚小管支架不易引起淚小管硬化、感染、栓子脫落或移位等，其治療效果似乎也更具有優勢，淚液量增加更為顯著，淚膜穩定性改善更為明顯[20-22]。

羊膜淚小管支架可以在很大程度上改善閹割去勢雄兔干眼癥的癥狀，在減少治療的不良反應和穩定淚膜的功能方面都能起到一定的作用。且羊膜淚小管支架給患者帶來的異物感較低，具有一定的臨床應用價值。但其在人干眼癥的治療過程中所可能帶來的不良反應猶未可知。同時，其對于不同程度干眼癥的治療效果也需進一步深入研究，以便于為干眼癥的治療提供更多的實驗依據。