氯化鋰通過TGFBI促進角膜基質成纖維細胞增殖和自噬

聶丹瑤，黎 明，葉 琳，賀溫玲，劉欣華

0引言

顆粒狀角膜營養不良(granular corneal dystrophy，GCD)是臨床常見的角膜營養不良之一，屬于常染色體顯性遺傳病，其發病率約為5.52/10000。由于5q31染色體上的轉化生長因子-β(TGFBI)基因發生突變，使得TGFBI蛋白(TGFBIp)在角膜基質層和彈力層聚集，并發生代謝障礙，導致患者雙側角膜出現混濁，最終造成視力損害[1]。在GCD早期，尚無有效的治療或緩解方法[2]。隨著GCD病情的惡化，可以采用手術方法來切除病變組織，包括板層角膜移植術和準分子激光角膜切削術[3]，但由于術后復發甚至加重的原因，其效果并不理想。因此，積極探索新的治療靶點將會有良好的應用前景。研究表明，TGFBI突變與GCD的發生密切相關。TGFBI在細胞增殖、分化、遷移和粘附等方面具有重要作用[4]，但TGFBI在GCD中具體的功能和機制還不完全清楚。氯化鋰(lithium chloride，LiCl)作為藥物廣泛應用于精神和神經系統疾病的治療[5]。研究表明，LiCl可抑制TGFBI的表達，并增加角膜成纖維細胞和癌細胞中糖原合成酶激酶-3 (Glycogen synthase kinase-3, GSK-3)與微管相關蛋白輕鏈3(LC3)的比例[6]。本研究進一步探討LiCl在突變型TGFBI轉染的角膜基質成纖維細胞中的功能及相關機制，期待未來可為角膜營養不良患者的藥物治療提供實驗依據。

1材料和方法

1.1材料收集2017-01/12就診于深圳市眼科醫院并接受手術治療的顆粒樣角膜營養不良病變患者3例，獲取3個角膜組織。所有角膜營養不良患者均經TGFBI基因突變DNA測序分析確診，且無遺傳或全身代謝性疾病史。同時，選取來自三個不同個體捐獻的正常角膜組織3個。角膜組織的取材及使用都經過患者知情同意，該研究經深圳市眼科醫院醫學倫理委員會批準。所有角膜組織在無菌條件下被切成20mg的組織塊分裝，-80℃保存。實驗試劑：DMEM培養基(Sigma，D1152)、胰蛋白酶(Gibco, 15090-046)、胎牛血清(FBS, Gibco, 26140087)、青霉素-鏈霉素雙抗(Gibco，15070-063)、DMSO(Sigma，D8418)、兔源單克隆抗TGFBI抗體(Abcam, Cambridge, UK)，兔源多克隆抗LC3抗體(Abcam)、兔源單克隆抗GAPDH抗體(Boster, Wuhan, China)、pcDNA3.0載體(Invitrogen, USA)、Bestar qPCR RT Kit(DBI, USA)、Bestar? SybrGreen qPCR-master Mix(DBI, USA)、RIPA(Beyotime, China)、ECL化學發光試劑(Beyotime, China)。

1.2方法

1.2.1免疫組織化學檢測角膜組織中TGFBI和LC3表達分別采用4%多聚甲醛固定GCD患者行板層角膜移植術切除的角膜組織和捐獻的正常角膜組織，石蠟包埋后切片，厚度4μm。37℃干燥過夜后，于1%過氧化氫溶液中浸泡20min。3%牛血清白蛋白室溫下孵育1h，并于兔源單克隆抗TGFBI抗體和兔源多克隆抗LC3抗體一抗(1∶500)4℃孵育過夜，鼠抗兔HRP標記IgG(1∶1000)二抗孵育后，DAB顯色，蘇木素染核后脫水封片。顯微鏡下觀察GCD角膜組織和正常角膜組織中TGFBI和LC3的表達。

1.2.2細胞培養根據文獻[7]提供方法，取板層角膜移植術切除下來正常角膜組織的基質層組織，生理鹽水清洗3次，抗生素液(100μg/mL鏈霉素+100U/mL青霉素)處理30min。在無菌條件下，去除角膜上皮層，將角膜基質層放入10% FBS的DMEM培養液，置于37℃、5% CO2培養箱中培養。7d后，Hanks液清洗，0.125%胰蛋白酶消化，離心后收集細胞。

1.2.3野生型和突變型TGFBI質粒構建采用PCR法擴增TGFBI。野生型TGFBI引物：正向引物5’-CCC AAG CTT ATG GCG CTC TTC GTG CG -3’, 反向引物: 5’- CCG CTC GAG CTA ATG CTT CAT CCT CTC TAA TAA CTT TT -3’。突變型TGFBI引物：正向引物5’- AGC TGT ACA CGG ACC ACA CGG AGA AGC TGA G -3’，反向引物 5’- CTC AGC TTC TCC GTG TGG TCC GTG TAC AGC T -3’。1%瓊脂糖凝膠電泳TGFBI擴增產物。將回收的TGFBI擴增產物和pcDNA3.0質粒酶切后進行電泳回收，T4連接酶連接后，轉化并提取重組質粒。

1.2.4細胞轉染和處理首先將構建的野生型和突變型TGFBI質粒轉染正常角膜基質成纖維細胞，轉染空載體作為對照組，轉染后留取0、12、24、36、48h的細胞做活性檢測并提取轉染后24h的細胞蛋白。其次，將LiCl溶于PBS中，并采用0、5、10、20、40mmol/L LiCl處理正常角膜基質成纖維細胞6h，留取處理后24h時的細胞做活性檢測。然后，同等濃度梯度的LiCl(KCl作為對照)處理突變型TGFBI轉染的角膜基質成纖維細胞6h，留取處理后24h時的細胞提取蛋白。根據正常角膜基質成纖維細胞的濃度梯度處理后的細胞活性結果，后續則采用20mmol/L LiCl處理突變型TGFBI轉染的角膜基質成纖維細胞，觀察不同時間(0、1、6、12h)后， TGFBI與LC3蛋白表達變化。最后，采用20mmol/L LiCl處理突變型TGFBI過表達載體轉染的角膜基質成纖維細胞12h，留取處理后24h時的細胞做活性檢測，并提取蛋白備用。

1.2.5 CCK-8法檢測細胞活力取上述處理后的角膜基質成纖維細胞，調整為1×103cells/mL濃度并鋪于96孔板中，每孔100μL，每組設6個復孔。每組細胞在特定時間加入CCK-8試劑，5% CO2孵箱37℃條件培養3h后，于酶標儀下測定450nm波長處吸光度值(OD值)。

1.2.6 Western-blot法檢測TGFBI和LC3表達RIPA提取了角膜營養不良及正常角膜組織及上述不同處理后的細胞總蛋白，按 BCA 蛋白濃度檢測試劑盒使用說明書檢測各組蛋白濃度。取40μg 各組總蛋白于8% SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白后轉膜。5%脫脂牛奶封閉，兔源單克隆抗TGFBI抗體(1∶2000)，兔源多克隆抗LC3抗體(1∶1000)、兔源單克隆抗抗GAPDH抗體(1∶5000)4℃孵育過夜。鼠抗兔HRP標記的IgG二抗(1∶5000)室溫孵育1h后，ECL顯色。

統計學分析：采用SPSS 20.0進行統計學分析，連續變量采用均數±標準差表示，組間差異檢驗采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1 TGFBI和LC3角膜組織中的表達免疫組織化學檢測結果顯示，與正常角膜組織相比，TGFBI和LC3在GCD患者角膜組織中呈強陽性表達(圖1A)。Western-blot檢測結果顯示，與正常角膜組織相比，TGFBI和LC3在GCD患者角膜組織中顯著高表達(圖1B)。

2.2 TGFBI過表達抑制角膜基質成纖維細胞活性分別構建野生型和突變型TGFBI過表達載體，并轉染角膜基質成纖維細胞。Western-blot檢測結果顯示，經野生型和突變型TGFBI過表達載體轉染的角膜基質成纖維細胞中TGFBI表達明顯增加，提示細胞轉染成功；與空載體轉染組相比，LC3在野生型TGFBI組細胞中的表達無明顯差異，而在突變型TGFBI組細胞中表達顯著增加，提示突變型TGFBI可顯著上調LC3表達(圖2A)。CCK-8實驗結果顯示，空載體轉染組、野生型TGFBI組、突變型TGFBI組細胞轉染后12、24、36h，野生型TGFBI組細胞活性均較空載體轉染組明顯減弱；突變型TGFBI組細胞活性較野生型TGFBI組顯著減弱，差異均有統計學意義(P<0.05，圖2B)。

圖1TGFBI與LC3蛋白在角膜組織中的表達A：免疫組織化學檢測TGFBI與LC3蛋白的表達(×100)；B：Western-blot法檢測TGFBI與LC3蛋白的表達。C：正常角膜組織；CD：GCD患者角膜組織。

2.3 LiCl對角膜基質成纖維細胞活性的影響分別采用0、5、10、20、40mmol/L LiCl處理正常角膜基質成纖維細胞6h，CCK-8法檢測結果顯示，LiCl對正常角膜基質成纖維細胞無毒性作用(圖3)。

2.4 LiCl對突變型TGFBI轉染的角膜基質成纖維細胞中TGFBI表達的影響分別采用5、10、20、40mmol/L LiCl處理突變型TGFBI轉染的角膜基質成纖維細胞6h，Western-blot檢測結果顯示，LiCl可抑制TGFBI蛋白表達水平，且隨著LiCl濃度的增加，TGFBI蛋白表達水平降低(圖4A)。采用20mmol/L LiCl分別處理突變型TGFBI轉染的角膜基質成纖維細胞0、1、6、12h，Western-blot檢測結果顯示，在20mmol/L LiCl作用下，隨著作用時間的延長，TGFBI蛋白表達水平降低(圖4B)。

2.5 LiCl對突變型TGFBI轉染的角膜基質成纖維細胞自噬和活性的影響采用20mmol/L LiCl處理突變型TGFBI過表達載體轉染的角膜基質成纖維細胞12h，Western-blot檢測結果顯示，與對照組相比，TGFBI和LC3蛋白表達水平在LiCl處理組顯著下調(圖5A)。CCK-8檢測結果顯示，與對照組相比，細胞活性在LiCl處理組明顯增加，差異有統計學意義(P<0.05，圖5B)。

3討論

自噬(autophagy)在細胞調控中起著重要作用，負責降解細胞內損傷蛋白質及功能失調細胞器。LC3作為自噬體膜上的標志蛋白，具有以LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ兩種形式存在[8]。在自噬過程中，LC3-Ⅰ經過一系列過程可轉變為LC3-Ⅱ，LC3-Ⅱ可與自噬體特異性結合，被廣泛用作自噬泡標記物[9]。近年來，越來越多的研究表明，自噬與角膜營養不良的發生和發展過程密切相關[10]。此外，研究表明，LiCl可通過誘導自噬抑制TGFBI的表達[11]。然而，突變型TGFBI與角膜基質成纖維細胞功能之間的關系尚未被研究。本研究通過TGFBI (G/A 371)的轉染，研究突變后角膜基質成纖維細胞對LiCl的敏感性。此外，我們發現，突變型TGFBI可促進自噬，突變型TGFBI的變化與角膜營養不良細胞的自噬增強有關。同時，我們證實，LiCl通過抑制自噬促進突變型TGFBI轉染的角膜基質成纖維細胞增殖活性。

TGFBI作為一種分泌蛋白，可被TGF-β誘導[12]。研究表明，TGFBI蛋白在角膜營養不良病變基質細胞中高表達。TGFBI可通過MMP-1、MMP-3和TIMP-1促進細胞外基質的降解，進而參與角膜的生理病理過程[13]。也有研究表明，在角膜成纖維細胞中，LiCl抑制TGF-β介導的TGFBI的表達[11]。研究也發現，角膜細胞在受到損傷刺激時會產生TGFBI，此外，角膜移植術和準分子激光角膜切削術后的GCD患者中也有TGFBI產生[14]。我們的研究進一步證實，與野生型TGFBI相比，突變型TGFBI對角膜基質成纖維細胞增殖活性的抑制作用更加強。同時，我們發現，野生型TGFBI不能誘導角膜基質成纖維細胞自噬，而突變型TGFBI可顯著誘導角膜基質成纖維細胞自噬。因此，這些結果表明TGFBI突變促進角膜基質成纖維細胞自噬。

圖2TGFBI過表達抑制角膜基質成纖維細胞活性A：Western-blot法檢測TGFBI與LC3蛋白的表達；B：CCK-8法檢測TGFBI過表達對角膜基質成纖維細胞活性的影響。aP<0.05vs空載體轉染組；cP<0.05vs野生型TGFBI組。

圖3LiCl對角膜基質成纖維細胞活性的影響。

圖4LiCl對突變型TGFBI轉染的角膜基質成纖維細胞中TGFBI表達的影響A： LiCl作用濃度對突變型TGFBI轉染的角膜基質成纖維細胞中TGFBI表達的影響；B: LiCl作用時間對突變型TGFBI轉染的角膜基質成纖維細胞中TGFBI表達的影響。

圖5LiCl對突變型TGFBI轉染的角膜基質成纖維細胞自噬和活性的影響A：LiCl對突變型TGFBI轉染的角膜基質成纖維細胞LC3表達的影響；B：LiCl對突變型TGFBI轉染的角膜基質成纖維細胞活性的影響。NC: 未經LiCl處理的突變型細胞對照組。aP<0.05vs未經LiCl處理的突變型細胞對照組。

LiCl作為GSK-3抑制劑，可抑制GSK-3磷酸化。研究表明，LiCl可參與多種生理調控過程，如基因表達、炎癥反應、細胞凋亡及糖原合成等[15]。最近的研究也表明，LiCl下調原發性角膜成纖維細胞中TGFBI的表達水平，并促進自噬[16]。本研究進一步證明，LiCl可抑制突變型TGFBI轉染的角膜基質成纖維細胞中TGFBI的表達水平，且呈劑量和時間依賴性。LiCl也可抑制突變型TGFBI轉染的角膜基質成纖維細胞自噬，并促進細胞增殖活性。提示LiCl可作為治療角膜營養不良的潛在治療靶點。