角膜堿燒傷中PMNs與MMP-9的關(guān)系

宋東宇，高明宏，李冬梅

0引言

角膜堿燒傷是臨床上常見的嚴(yán)重致盲性眼外傷，由于堿易于浸潤(rùn)至深層角膜，造成角膜病灶組織的潰瘍?nèi)芙猓瑹齻缙诩从袕?fù)雜的炎癥反應(yīng)，多形核中性白細(xì)胞(polymorphonuclear neutrophils，PMNs)為病灶內(nèi)重要的炎性細(xì)胞。PMNs浸潤(rùn)角膜基質(zhì)層并不斷吞噬壞死組織，直至引起PMNs細(xì)胞溶酶體破裂，產(chǎn)生大量蛋白酶加重基質(zhì)層的潰瘍?nèi)芙鈁1]。角膜基質(zhì)層中含有大量的膠原成分，在堿燒傷潰瘍損傷過(guò)程中有大量細(xì)胞因子、酶類參與，其中基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)在損傷中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，MMP-9又稱明膠酶B，活化后能分解多種膠原成分，易造成角膜基質(zhì)層嚴(yán)重的潰瘍?nèi)芙鈁2]。堿燒傷后的病理?yè)p傷機(jī)制非常復(fù)雜，角膜病灶區(qū)嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)和基質(zhì)層潰瘍?nèi)芙獠⒋妫瑑烧呤欠窬哂幸恢滦裕绾握J(rèn)識(shí)PMNs與MMP-9的相互作用及其關(guān)系，尚需深入研究。本文通過(guò)建立在體動(dòng)物角膜堿燒傷模型，探究角膜堿燒傷后PMNs浸潤(rùn)和MMP-9的表達(dá)時(shí)相，并且創(chuàng)新性的研究二者的相關(guān)性，為深入研究及治療角膜堿燒傷提供理論依據(jù)。

圖1裂隙燈下觀察角膜堿燒傷情況A：堿燒傷后3d,角膜基質(zhì)層潰瘍水腫，病灶邊界不清；B：堿燒傷后14d,角膜基質(zhì)層嚴(yán)重潰瘍?nèi)芙猓籆：堿燒傷后28d，角膜基質(zhì)層潰瘍減輕，瘢痕形成。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用健康清潔級(jí)新西蘭白兔25只(首都醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物研究中心提供)，10～12月齡，體質(zhì)量2.0～3.0kg，雌雄均用，右眼為實(shí)驗(yàn)眼，左眼為正常對(duì)照眼，實(shí)驗(yàn)前仔細(xì)檢查眼部無(wú)病變。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，嚴(yán)格遵循國(guó)家科技部頒布的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》，同時(shí)本研究獲得朝陽(yáng)市中心醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.1.2實(shí)驗(yàn)器材使用試劑：鼠抗兔MMP-9抗體(Abcam)；辣根酶標(biāo)記山羊抗鼠IgG、SP及DAB試劑盒(Bioss);纖維濾紙(BOSTER)。使用儀器：超凈工作平臺(tái)(SW-CJ-IFD，沈陽(yáng))、勻速振蕩器(JHYC-3，蘇州)、水浴箱(ZD600，蘇州)、精密切片機(jī)(HM325，美國(guó))、漂烘器(ZMN-6802，日本)、圖像分析儀(Image8000，北京)、裂隙燈(SL-6F，蘇州)、高倍顯微鏡(CK53，深圳)和圖像分析系統(tǒng)(Image Plus6.0，沈陽(yáng))。

1.2方法

1.2.1角膜堿燒傷模型的建立依據(jù)中華醫(yī)學(xué)會(huì)眼外傷學(xué)組制定的角膜燒傷標(biāo)準(zhǔn)，建立兔右眼角膜Ⅲ級(jí)堿燒傷的動(dòng)物模型，操作由同一有經(jīng)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)人員完成。為確保濾紙片大小形狀一致，用直徑為8.0mm的角膜移植環(huán)鉆鉆取多張圓形單層濾紙片，充分浸泡于1.0mol/L NaOH溶液中10s，鑷子夾取后置于器皿盒內(nèi)備用。器械固定實(shí)驗(yàn)兔頭部，右眼置開瞼器，20g/L鹽酸丙美卡因滴眼液點(diǎn)眼4次充分表面麻醉，把浸泡備用的濾紙片置于角膜中央?yún)^(qū)，確保濾紙與角膜表面充分接觸，計(jì)時(shí)1min后取下，注射器抽取大量生理鹽水沖洗上瞼穹窿部及角結(jié)膜表面5min，確保無(wú)NaOH溶液殘留(經(jīng)反復(fù)預(yù)實(shí)驗(yàn)，堿燒傷角膜1min,生理鹽水沖洗5min，能確保角膜達(dá)到Ⅲ級(jí)燒傷，且燒傷程度不至于角膜穿孔)。按此方法對(duì)25只兔右眼均進(jìn)行角膜堿燒傷模型的建立[2]。

1.2.2模型治療及處理角膜堿燒傷后3d內(nèi)，角膜損傷較重，為避免角膜穿孔和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的眼部不適，兔雙眼(實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組)均給予非抗生素藥物，小牛血去蛋白提取物眼用凝膠，4次/d，點(diǎn)雙眼。分別于堿燒傷后3、7、14、21和28d從模型兔中隨機(jī)選取5只，按照0.2mL/100g體質(zhì)量腹腔注射氯胺酮和氯丙嗪1∶1混合液麻醉后，裂隙燈下觀察雙眼角膜并進(jìn)行眼表照相，隨即靜脈注入空氣窒息法處死[2]。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物發(fā)生嚴(yán)重眼內(nèi)出血或角膜溶解穿孔則予剔除。

1.2.3角膜處理和數(shù)據(jù)獲取兔被麻醉處死后，沿角膜緣環(huán)形剪開球結(jié)膜及筋膜，快速剪斷眼外肌和視神經(jīng)，摘除雙側(cè)眼球，完整切取帶有1.0mm寬鞏膜的角膜組織，10%甲醛溶液固定24～48h，常規(guī)不同濃度乙醇梯度脫水，應(yīng)用二甲苯溶液致透明化，石蠟包埋，4μm連續(xù)切片[1]。

2結(jié)果

2.1裂隙燈下觀察堿燒傷后3d兔右眼球表面大量粘稠分泌物，燒傷病灶呈現(xiàn)邊界不清的灰白色潰瘍，深度達(dá)角膜基質(zhì)層，窺視不清眼內(nèi)結(jié)構(gòu)(圖1A)。14d實(shí)驗(yàn)組的角膜潰瘍深度及面積最為嚴(yán)重，病灶周邊大量新生血管生長(zhǎng)，角膜病灶潰瘍?nèi)芙庾钪兀_(dá)高峰期(圖1B)。28d實(shí)驗(yàn)組角膜潰瘍區(qū)基本瘢痕化，表面新生血管生長(zhǎng)，透明度極差(圖1C)。對(duì)照組角膜無(wú)明顯變化。

圖2HE染色切片觀察PMNs和新生血管(×400)A：堿燒傷后3d；B：堿燒傷后14d。三角示PMNs,箭頭示新生血管。B圖與A圖比較，可見堿燒傷后PMNs和新生血管增多,角膜基質(zhì)纖維更為紊亂。

圖3MMP-9陽(yáng)性表達(dá)(SABC×400)A：角膜堿燒傷后14d，大量MMP-9表達(dá)；B：角膜堿燒傷后28d，MMP-9表達(dá)趨于下降。

組別眼數(shù)MMP-9實(shí)驗(yàn)組內(nèi)相互比較q值(P值)7d14d21d28d正常對(duì)照組250.0015±0.0006堿燒傷3d50.2842±0.01304.1534(<0.05)10.1663 (<0.01)4.7294(<0.05)2.4355(>0.05)堿燒傷7d50.2431±0.015014.3197 (<0.01)8.8829(<0.01)1.7180(>0.05)堿燒傷14d50.3848±0.03405.4368(<0.01)12.6017(<0.01)堿燒傷21d50.3310±0.02707.1649(<0.01)堿燒傷28d50.2601±0.0130

2.2 HE染色切片觀察400倍生物顯微鏡下觀察HE染色切片，PMNs為鏡下視野內(nèi)胞核藍(lán)色且深染的細(xì)胞。堿燒傷后3d，角膜潰瘍區(qū)上皮組織缺如，基質(zhì)層水腫肥厚，膠原纖維部分紊亂，角膜上皮下及基質(zhì)層可見少量PMNs；堿燒傷后14d，病灶區(qū)周邊殘存的上皮層細(xì)胞水腫，基質(zhì)層溶解變薄，大量纖維溶解斷裂且排列紊亂，可見新生血管生長(zhǎng)，特別是潰瘍?nèi)芙鈪^(qū)的基質(zhì)層細(xì)胞中存在大量PMNs浸潤(rùn)，呈團(tuán)簇樣存在且胞核較大(圖2)。

2.3 PMNs的量值兔角膜堿燒傷后3、7、14、21、28d角膜病灶組織中PMNs密度值分別為58.34±4.67、46.34±2.36、90.07±5.67、83.23±3.31和43.28±3.45個(gè)/1000μm2。正常對(duì)照組角膜基質(zhì)內(nèi)幾乎未見PMNs細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)組不同時(shí)間點(diǎn)PMNs密度值變化比較明顯，堿燒傷后3d角膜基質(zhì)層即可見大量PMNs浸潤(rùn)，7d時(shí)數(shù)量略有下降，繼而快速增多，即在14d時(shí)達(dá)到頂峰，之后逐漸減少，28d時(shí)下降至接近7d時(shí)數(shù)量。

2.4角膜堿燒傷后MMP-9的表達(dá)堿燒傷后的角膜基質(zhì)層溶解高峰出現(xiàn)在14d，觀察免疫組化圖片可發(fā)現(xiàn)堿燒傷14d的角膜基質(zhì)層中MMP-9的量值達(dá)到頂峰，隨后角膜堿燒傷后的28d，MMP-9的表達(dá)明顯減少，角膜溶解潰瘍的病損修復(fù)過(guò)程與MMP-9的表達(dá)緊密相關(guān)(圖3)。

經(jīng)檢驗(yàn)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布，滿足方差齊性，實(shí)驗(yàn)組內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)MMP-9陽(yáng)性細(xì)胞平均光密度值隨時(shí)間延長(zhǎng)出現(xiàn)明顯波動(dòng)(先上升后下降)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=33.78，P<0.01)。兔左眼為對(duì)照組(正常眼)，各時(shí)間點(diǎn)MMP-9陽(yáng)性細(xì)胞平均光密度值平穩(wěn)無(wú)變化，求取平均值作為對(duì)照組均值。不同時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組MMP-9陽(yáng)性細(xì)胞平均光密度值均高于對(duì)照組，組間均數(shù)比較用Dunnett-t檢驗(yàn)(表1)，3、7、14、21和28d差異明顯，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)組內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)的MMP-9陽(yáng)性細(xì)胞平均光密度值相互比較用SNK-q檢驗(yàn)(表1)，可見不同時(shí)間點(diǎn)MMP-9陽(yáng)性細(xì)胞平均光密度值變化明顯(P<0.05)，堿燒傷后3d即有大量MMP-9產(chǎn)生，7d時(shí)有所下降，之后明顯提升且在14d時(shí)達(dá)到高峰，14d后逐漸降低，在28d降至接近燒傷7d時(shí)水平。

2.5量值相關(guān)性角膜堿燒傷后病灶組織內(nèi)PMNs的浸潤(rùn)與MMP-9的表達(dá)的量值呈正態(tài)分布，對(duì)兩組數(shù)值進(jìn)行Pearson相關(guān)性檢驗(yàn)，呈正相關(guān)(r=0.963，P=0.004)。

3討論

角膜堿燒傷是臨床上較為多見的，治療較為困難的嚴(yán)重眼表疾病，早期即出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，隨著病程的進(jìn)展常可見眼表持續(xù)性病損、角膜潰瘍?nèi)芙狻⒔悄せ鞚狁：奂按罅啃律艿龋绕涫墙悄せ|(zhì)層損傷較重，細(xì)胞外基質(zhì)(extracelluar matrix,ECM)主要包括膠原、蛋白多糖、糖蛋白、糖胺多糖和彈力纖維五大類，其中膠原是ECM中最豐富的結(jié)構(gòu)成分。基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)可作為降解細(xì)胞外基質(zhì)的酶類，在角膜組織潰瘍?nèi)芙鈸p傷及細(xì)胞遷移修復(fù)中發(fā)揮重要的作用[3]，而MMP-9作為MMPs家族中的重要一員，在角膜基質(zhì)的病理?yè)p傷過(guò)程中能夠降解大量膠原[4-5]。MMP-9又被稱為明膠酶B，相對(duì)分子量為92kD，以無(wú)活性的酶原形式分泌，主要存在于角膜基質(zhì)層中，活化后能降解Ⅳ型膠原、Ⅴ型膠原、彈性蛋白和明膠。正常角膜中只能微量檢測(cè)到MMP-9表達(dá)，而在兔角膜堿燒傷后的病灶區(qū)內(nèi)，MMP-9表達(dá)明顯增加，在我們的研究中，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的量值做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可以說(shuō)明MMP-9在角膜堿燒傷后的潰瘍?nèi)芙庵芯哂兄匾饔茫⑶遗c炎性反應(yīng)明顯呈正相關(guān)。在本研究中發(fā)現(xiàn)，免疫定位MMP-9，其主要分布于潰瘍的角膜基質(zhì)、浸潤(rùn)的炎細(xì)胞和新生血管的內(nèi)皮細(xì)胞中，這與Ma等[6]通過(guò)原位酶譜技術(shù)檢測(cè)的研究結(jié)果相一致，MMP-9能夠大量降解角膜基質(zhì)，從而引起嚴(yán)重的損傷。

研究發(fā)現(xiàn)堿燒傷后3d角膜上皮層及基質(zhì)層病灶中就存在大量的PMNs浸潤(rùn)，第7d量值卻有下降，堿燒傷后的14d則達(dá)到浸潤(rùn)的峰值，大量角膜基質(zhì)潰瘍?nèi)芙猓踔潦谴┛祝瑐?4d為角膜組織病理?yè)p傷的嚴(yán)重期，炎癥反應(yīng)也最為嚴(yán)重，PMNs浸潤(rùn)達(dá)到最大值，角膜堿燒傷后的潰瘍?nèi)芙馀cPMNs的浸潤(rùn)水平顯著相關(guān)，這與報(bào)道文獻(xiàn)[2,7]的研究一致。因正常對(duì)照組的角膜基質(zhì)層未見明顯的PMNs存在，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組差異明顯，我們未進(jìn)行組間的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。在空間分布上，早期PMNs分布在堿燒傷創(chuàng)口邊緣的角膜基質(zhì)內(nèi)，主要有外源性堿性物質(zhì)致傷所引起，角膜表面無(wú)浸潤(rùn)；后期PMNs浸潤(rùn)部位與潰瘍部位一致，主要是與免疫性炎癥反應(yīng)相關(guān)，這與Peebo等[8]的研究結(jié)果相同。堿燒傷后PMNs浸潤(rùn)損傷角膜組織的病程進(jìn)展快速，進(jìn)入角膜基質(zhì)的PMNs大量吞噬壞死物質(zhì)，進(jìn)而使溶酶體破裂，溶酶體酶大量進(jìn)入角膜燒傷潰瘍區(qū)，對(duì)膠原進(jìn)行溶解破壞，有研究證實(shí)明膠酶MMP-9與中性白細(xì)胞相關(guān)[9-11]。Noerager等[12]通過(guò)對(duì)外周血中的PMNs細(xì)胞分離提取后，在PMNs碎裂物及上清液中分離到MMP-9的存在。而我們的研究是通過(guò)制做角膜堿燒傷的動(dòng)物模型，在活體動(dòng)物的角膜炎性病灶組織中測(cè)得PMNs及MMP-9的量值，所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)更準(zhǔn)確、直觀，并對(duì)堿燒傷不同時(shí)相的PMNs與MMP-9量值做Pearson相關(guān)性檢驗(yàn)，相關(guān)系數(shù)r=0.963，P=0.004，從而創(chuàng)新性地證明了二者關(guān)系密切，且具有明顯正相關(guān)性。實(shí)驗(yàn)方式不同，無(wú)論是通過(guò)外周血的細(xì)胞提取，還是通過(guò)直接的活體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，其結(jié)果具有一致性，但我們的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)直接在角膜炎癥病灶內(nèi)測(cè)得，更能表達(dá)和證實(shí)二者的相關(guān)性，且通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析證實(shí)相關(guān)性明顯具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

按照McCulley的研究，化學(xué)性角膜燒傷可以分為以下四期：角膜燒傷期(燒傷當(dāng)時(shí))、損傷急性期(0～7d)，角膜修復(fù)早期(1～3wk)和角膜修復(fù)晚期(大于3wk)[2,13]，我們通過(guò)建立動(dòng)物模型，研究堿燒傷急性期、修復(fù)早期和修復(fù)晚期的角膜潰瘍區(qū)的組織病理?yè)p傷及病程進(jìn)展中PMNs浸潤(rùn)和MMP-9表達(dá)的時(shí)相，依據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析充分證實(shí)二者具有明顯正相關(guān)性，該理論能夠?yàn)榕R床治療角膜堿燒傷提供新思路。臨床上治療早期角膜堿燒傷，控制炎癥即是抑制PMNs的浸潤(rùn)和減少M(fèi)MP-9的大量表達(dá)，依據(jù)二者的正相關(guān)性，抑制炎性反應(yīng)，促進(jìn)上皮的早期修復(fù)，可以減少角膜病灶的潰瘍?nèi)芙猓M(jìn)而有效地減輕角膜病灶的病理性損傷。

依據(jù)本研究中PMNs及MMP-9的變化曲線，在角膜堿燒傷后3d內(nèi)就要頻點(diǎn)抗炎眼液，早期應(yīng)用小牛血去蛋白提取物眼用凝膠類藥物，稀釋殘存堿性物質(zhì)，促進(jìn)上皮層的修復(fù)，減少炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，而7～21d是燒傷后的角膜潰瘍?nèi)芙馄冢诳寡字委煹耐瑫r(shí)要抑制基質(zhì)蛋白酶類的溶解作用。堿燒傷14d后，即可應(yīng)用促進(jìn)上皮和基質(zhì)修復(fù)的眼膏或眼液，進(jìn)而達(dá)到促進(jìn)修復(fù)減少瘢痕的最佳療效[2,13]。在臨床診治上，炎癥反應(yīng)和MMPs的潰瘍降解密切相關(guān)，角膜堿燒傷的病理?yè)p傷是多因素共同作用的結(jié)果，炎癥反應(yīng)與新生血管生長(zhǎng)因子的相互關(guān)系，MMPs家族中其他的酶類因子是否與炎性反應(yīng)相關(guān)，尚需實(shí)驗(yàn)研究。